煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞Nrf2-Keap1-ARE通路的作用.pdf

1、煤焦瀝青(Coal tar pitch,CTP)是煤炭煉焦過程中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品,主要用于涂料、塑料、橡膠及煉鋼等工業(yè)中。大量流行病學資料表明,煤焦瀝青接觸者肺癌發(fā)病率明顯高于正常人群,它所引起的肺癌已經(jīng)歸為職業(yè)腫瘤。
　　煤焦瀝青煙的主要成份多環(huán)芳烴,是一種公認的致癌物。一般情況下,致癌物在生物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化依靠肝臟Ⅰ相和Ⅱ相代謝酶來完成,經(jīng)Ⅰ相代謝酶(如細胞色素P450)催化后形成親電子活性致癌物,與DNA及蛋白質(zhì)結(jié)合形成加合物,引

2、起癌基因和抑癌基因改變;而經(jīng)Ⅱ相代謝酶,如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathioneS-transferase,GST)的生物轉(zhuǎn)化作用,使終致癌物親水性增強,促進其體外排泄。這些Ⅱ相代謝酶的協(xié)同誘導反應通過靶基因調(diào)控區(qū)稱為抗氧化反應元件(ARE)或親核反應元件(EpRE)的順式作用元件調(diào)控。Nrf2-Keap1/ARE信號通路的激活可以誘導一系列內(nèi)源性抗氧化酶和抗氧化蛋白的表達,在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮“雙刃劍”功能,在正常狀態(tài)或亞

3、毒性劑量的刺激下,Nrf2-Keap1/ARE通路調(diào)節(jié)Ⅱ相代謝酶表達,使細胞免受氧化損傷;但在腫瘤細胞中,Ⅱ相代謝酶表達作用不受抑制,增加了腫瘤細胞對氧化應激的耐受和增殖能力,從而對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。
　　因此Nrf2-Keap1/ARE通路成為氧化應激、癌癥預防等領域的研究熱點。Nrf2-Keap1系統(tǒng)在細胞抵御外源性或內(nèi)源性氧化應激的機制中占有重要地位。Nrf2缺失和激活障礙與化合物致癌、藥物性肝損傷、炎癥修復延遲、細胞凋亡

4、等病變過程相關。目前認同的Nrf2激活機制包括Nrf2與Keap1的解耦連、蛋白酶對Nrf2的降解減弱、Nrf2磷酸化等。隨著對Nrf2-Keap1在細胞應激保護、損傷修復等諸多方面認識的深入及作用機制的了解,Nrf2-Keap1將為抗腫瘤、抗炎癥治療提供新的思路。在哺乳動物中,Nrf2-Keap1/ARE通路是細胞抗氧化反應的中樞調(diào)節(jié)者。Nrf2通過與ARE相互作用調(diào)節(jié)抗氧化蛋白和代謝酶的表達,因此該通路是癌癥化學預防的研究熱點。

5、r>　　研究用不同濃度的煤焦瀝青煙提取物染毒人支氣管上皮細胞(BEAS-2B),從mRNA水平上分析其對BEAS-2B細胞表達Nrf2、Keap1和NQO1的影響,Western blotting驗證其對Nrf2蛋白的影響。探討Nrf2-Keap1/ARE通路在煤焦瀝青煙提取物致細胞氧化損傷中的作用,為進一步研究煤焦瀝青致癌及預防提供理論依據(jù)。
　　方法:1.煤焦瀝青煙提取物的制備和對細胞增殖的影響。400℃加熱煤焦瀝青,粉塵采樣

6、器收集產(chǎn)生煙氣,乙酸乙酯溶解纖維素膜上的煤焦瀝青煙顆粒,揮發(fā)濃縮后,用二甲基亞砜溶解,氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用技術分析其成分。用其染毒BEAS-2B細胞,分析對該細胞增殖的影響。2.煤焦瀝青煙提取物對Nrf2、Keap1和NQO1基因轉(zhuǎn)錄的影響。以煤焦瀝青煙提取物0.00、1.25、2.50、5.00、10.00μg/ml染毒BEAS-2B細胞24h,提取總RNA,進行逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR),以GADPH為內(nèi)參照,檢

7、測Nrf2、Keap1、NQO1 mRNA的表達水平。3.煤焦瀝青煙提取物對Nrf2蛋白表達的影響。以0.00、1.25、2.50、5.00、10.00μg/ml染毒濃度干預BEAS-2B細胞24h,提取總蛋白,Western blotting檢測蛋白表達情況,以β-acting為內(nèi)參照,半定量測定Nrf2蛋白的表達。4.統(tǒng)計分析。運用SPSS12.0統(tǒng)計軟件,Kolmogorov-Smirnov正態(tài)性檢驗、Levene方差齊性檢驗、單

8、因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析(檢驗水準α=0.05)。
　　結(jié)果:1.煤焦瀝青煙提取物經(jīng)GC-MS分析,主要成分為稠環(huán)芳烴類,用該提取物染毒BEAS-2B細胞24h,MTT檢測細胞活性,結(jié)果顯示染毒濃度為1.25μg/ml時,刺激細胞的增殖,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),2.50μg/ml~10.Oμg/ml之間,抑制細胞的增殖,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。2.煤焦瀝青煙提取物以0.00、1.25、2.50、5.00、

9、10.00μg/ml染毒BEAS-2B細胞24h,①染毒組Nrf2 mRNA及蛋白相對表達量低于對照組,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05),②實驗組Keap1 mRNA表達量比對照組高,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。③NQO1 mRNA相對表達量方差分析結(jié)果顯示5.00、10.00μg/ml NQO1基因相對表達量比對照高,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05),隨著染毒濃度的增加,NQO1基因的表達有增加的趨勢。
　　結(jié)論:1.不同

10、劑量的煤焦瀝青煙提取物對BEAS-2B細胞的增殖產(chǎn)生截然不同的結(jié)果,低濃度時(1.25μg/ml)可刺激細胞的增殖,高濃度時(2.5、5.0、10.00μg/ml)可顯著地抑制細胞的增殖,隨劑量增加抑制作用增強;2.隨著煤焦瀝青煙提取物染毒濃度的增加,Nrf2 mRNA和蛋白表達呈遞增趨勢,Keap1基因mRNA表達量逐漸降低,NQO1基因表達量隨著染毒濃度的增加而增加,提示BEAS-2B細胞可能通過Nrf2-Keap1通路調(diào)節(jié)下游NQ