經(jīng)動(dòng)脈灌注地塞米松對(duì)大鼠腦缺血-再灌注模型的神經(jīng)保護(hù)作用研究.pdf

1、腦卒中是人類致殘、致死的主要病因之一。在我國(guó)，腦卒中是第一位的致死因素，2013年的數(shù)據(jù)表明:中風(fēng)造成我國(guó)70歲以上人群200萬(wàn)人的死亡，而在49歲以下人群，中風(fēng)也是導(dǎo)致死亡的主要原因之一。急性缺血性卒中是最多見(jiàn)的卒中類型，約占患者總數(shù)的80％。腦缺血后會(huì)引發(fā)一系列的病理生理及生化反應(yīng)，如乳酸堆積、自由基釋放、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、興奮性氨基酸中毒、炎性過(guò)程及凋亡等，稱為腦缺血的瀑布級(jí)聯(lián)反應(yīng)。其中炎性反應(yīng)在腦缺血損傷的發(fā)展過(guò)程中的扮演著重要角色

2、。腦缺血誘導(dǎo)炎性因子大量產(chǎn)生，引起急性炎癥反應(yīng)，加重患者腦損害。
　　糖皮質(zhì)激素類藥物具有快速而強(qiáng)大的抗炎作用。既往的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，糖皮質(zhì)激素類藥物可以降低腦缺血所致的腦損害，是一種潛在的神經(jīng)保護(hù)劑。早期的臨床實(shí)驗(yàn)也證實(shí)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素類藥物能夠降低缺血性卒中患者的死亡率，改善患者神經(jīng)功能。然而，在此后的多個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)中，糖皮質(zhì)激素類藥物未表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)作用，甚至有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，生理劑量糖皮質(zhì)激素會(huì)加重腦缺血大鼠的神經(jīng)損害。目前，對(duì)于糖皮

3、質(zhì)激素類藥物在缺血性卒中治療上的價(jià)值存在爭(zhēng)議。
　　分析既往實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):大劑量糖皮質(zhì)激素類藥物對(duì)腦缺血多具有顯著的治療作用，而生理劑量則多無(wú)效，甚至加重神經(jīng)損害;治療有效的實(shí)驗(yàn)，給藥時(shí)間多在腦缺血之前或缺血后立即給藥。由此推測(cè):糖皮質(zhì)激素類藥物對(duì)腦缺血的治療作用呈明顯的時(shí)間-劑量依賴關(guān)系，即梗死早期大劑量糖皮質(zhì)激素類藥物治療能夠產(chǎn)生顯著的神經(jīng)保護(hù)作用。本研究利用大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型，給予大劑量地塞米松，對(duì)地塞米松治療缺血性卒中的時(shí)

4、間依賴性及其機(jī)制進(jìn)行了探討。
　　大劑量地塞米松治療會(huì)造成藥物副作用的增加，而嚴(yán)格的治療時(shí)間窗必然會(huì)限制藥物的臨床應(yīng)用。與傳統(tǒng)的經(jīng)靜脈給藥相比，經(jīng)動(dòng)脈給藥治療，藥物直達(dá)病變組織，不經(jīng)肝臟代謝，避免了藥物的“首過(guò)效應(yīng)”，不但可以獲得更高的局部藥物濃度，并且由于藥物作用集中在給藥部位，減少了藥物的全身毒、副作用。再者，由于藥物直達(dá)病變部位，避免了藥物經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)病變部位的時(shí)間延遲，經(jīng)動(dòng)脈給藥縮短了藥物在局部達(dá)到治療濃度所需的時(shí)間，為

5、缺血性卒中的治療爭(zhēng)取了寶貴的“時(shí)間窗”。經(jīng)動(dòng)脈藥物灌注可以很好地解決地塞米松的治療劑量大和治療時(shí)間窗狹窄的問(wèn)題。在進(jìn)一步的研究中，利用改進(jìn)的經(jīng)動(dòng)脈藥物灌注方法，探究了經(jīng)動(dòng)脈地塞米松灌注對(duì)地塞米松治療時(shí)間窗和治療劑量的影響。
　　第一部分 大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型基礎(chǔ)上的經(jīng)動(dòng)脈藥物灌注方法改進(jìn)
　　目的:改進(jìn)經(jīng)動(dòng)脈藥物傳輸方法，建立適用于經(jīng)動(dòng)脈藥物灌注研究的大鼠缺血性卒中模型。
　　方法:經(jīng)動(dòng)脈藥物灌注微管裝置的制作:用環(huán)

6、氧化物膠包裹的1mm長(zhǎng)的尼龍線（外徑:0.181 mm）堵塞的PE-0402管（長(zhǎng)約50mm）的一端。在距離PE-0402管被堵塞端2mm處的側(cè)壁做1mm長(zhǎng)的縱行切口，作為藥物的輸出口。經(jīng)頸外動(dòng)脈插入微管裝置，使其頭端堵塞到達(dá)大腦中動(dòng)脈開(kāi)口，在選定的時(shí)間點(diǎn)，使用微管裝置，經(jīng)頭端縱行切口向動(dòng)脈傳輸藥物，使用一個(gè)微管裝置，同時(shí)達(dá)到閉塞大腦中動(dòng)脈和經(jīng)動(dòng)脈藥物傳輸?shù)哪康?。為檢驗(yàn)微管裝置誘導(dǎo)局灶腦缺血的能力，利用廣泛使用的線栓（線栓組）和自制的微

7、管裝置（微管組）分別建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型，建模后24h，比較兩組大鼠的神經(jīng)缺損評(píng)分和腦梗死的體積。為檢驗(yàn)改進(jìn)方法的藥物傳輸能力，對(duì)比了原有經(jīng)動(dòng)脈藥物傳輸方法（PE-10組）與改進(jìn)方法(microcatheterdevice組)的藥物傳輸效率。大腦中動(dòng)脈閉塞模型建立后2h，通過(guò)不同方法向模型大鼠灌注等量伊文斯藍(lán)溶液。灌注后4h，利用分光光度法檢測(cè)不同組別大鼠梗死半球的伊文斯藍(lán)滲出量。
　　結(jié)果:模型建立后24h，線栓組和微管組

8、大鼠的神經(jīng)缺損評(píng)分相當(dāng)，兩組大鼠腦梗死的體積差別沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。伊文斯藍(lán)灌注后4h，microcatheter device組大鼠梗死半球的伊文斯藍(lán)的滲出量為35.9±7.7μ g/g，顯著高于PE-10組(17.7±4.4μ g/g)。
　　結(jié)論:1.本研究改進(jìn)了大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型基礎(chǔ)上的經(jīng)動(dòng)脈藥物灌注方法，使用同一微管裝置同時(shí)達(dá)到閉塞大鼠大腦中動(dòng)脈和經(jīng)動(dòng)脈藥物灌注的目的;2.微管裝置誘導(dǎo)大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞的能力與廣泛使用的

9、線栓相當(dāng)，其藥物傳輸效能較已有方法更高;3.使用微管裝置的動(dòng)脈給藥方法造模更簡(jiǎn)單、梗死更穩(wěn)定，并且可適用于不同研究策略:藥物傳輸可以在缺血-再灌注之前也可以在缺血-再灌注之后，可以用于缺血-再灌注模型的經(jīng)動(dòng)脈藥物傳輸研究，也可以用于永久梗死模型的相關(guān)研究。
　　第二部分 大劑量地塞米松對(duì)大鼠腦缺血-再灌注模型的神經(jīng)保護(hù)作用研究
　　目的:研究大劑量地塞米松對(duì)缺血性卒中的治療效果并探索其治療時(shí)間窗及機(jī)制。
　　方法:線栓

10、法建立大鼠腦缺血-再灌注模型，在建模后不同時(shí)間點(diǎn)(30min、60min、120min)，經(jīng)靜脈給予10mg/kg地塞米松。在缺血腦組織再灌注后48h，比較不同組別大鼠的神經(jīng)缺損評(píng)分和腦梗死體積，探索大劑量地塞米松治療缺血性卒中的療效及時(shí)間依賴性。為進(jìn)一步探究地塞米松治療缺血性卒中的機(jī)制，利用免疫組織化學(xué)、Western blot和ELISA等檢測(cè)手段，比較了不同時(shí)間點(diǎn)(30min、60min)給藥對(duì)NF-kB激活及炎性因子（TNF-α

11、、IL-1β、COX-2、iNOS）表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:30min給藥組大鼠的神經(jīng)缺損評(píng)分(1.9±0.7)和梗死體積(20.4±6.1％)，較梗死對(duì)照組明顯降低。60min組、120min組大鼠的神經(jīng)缺損評(píng)分和梗死體積與梗死對(duì)照組相當(dāng)。免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果顯示，大腦中動(dòng)脈閉塞后30min給予大劑量地塞米松，能夠顯著降低海馬區(qū)NF-kB p65的表達(dá)。Western blot發(fā)現(xiàn)大腦中動(dòng)脈閉塞后2h，梗死周邊區(qū)NF-kB p

12、65、p-p65表達(dá)量一過(guò)性增高，而在大腦中動(dòng)脈閉塞后30min給予大劑量地塞米松，能夠顯著抑制梗死周邊區(qū)的NF-kB p65、p-p65表達(dá)增加，減少炎性因子（COX-2、iNOS）產(chǎn)生。ELISA發(fā)現(xiàn)，大腦中動(dòng)脈堵塞后30min給予大劑量地塞米松顯著降低了梗死周邊區(qū)促炎因子（TNF-α、IL-1β）的水平。
　　結(jié)論:1.大劑量地塞米松治療對(duì)腦缺血-再灌注大鼠模型有神經(jīng)保護(hù)作用，并且具有嚴(yán)格的治療時(shí)間窗;2.大劑量地塞米松對(duì)腦

13、缺血-再灌注大鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用與地塞米松抑制NF-kB激活從而減少炎性因子的產(chǎn)生相關(guān)。
　　第三部分 經(jīng)動(dòng)脈灌注地塞米松對(duì)大鼠腦缺血-再灌注模型的神經(jīng)保護(hù)作用研究
　　目的:探討經(jīng)動(dòng)脈給藥對(duì)地塞米松的治療劑量和治療時(shí)間窗的影響。
　　方法:利用微管裝置建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型，分別在模型建立后30min和60min，按照不同劑量（10mg/kg或者2mg/kg），經(jīng)不同方式（經(jīng)靜脈或者經(jīng)動(dòng)脈）給予地塞米松或安慰劑

14、。腦缺血-再灌注后48h，比較不同組別大鼠的神經(jīng)缺損評(píng)分、運(yùn)動(dòng)功能（前肢錯(cuò)誤放置測(cè)試、平行棒測(cè)試、攀繩測(cè)試）及梗死體積。
　　結(jié)果:大腦中動(dòng)脈閉塞后60min，經(jīng)動(dòng)脈小劑量地塞米(2mg/kg)松灌注能夠顯著改善腦缺血-再灌注大鼠模型的神經(jīng)缺損評(píng)分，提高其運(yùn)動(dòng)能力，減小梗死體積。其治療效果與大腦中動(dòng)脈閉塞后30min，經(jīng)靜脈大劑量地塞米(10mg/kg)治療相當(dāng)。
　　結(jié)論:經(jīng)動(dòng)脈地塞米松灌注可以擴(kuò)展地塞米松治療缺血性卒中的