microRNA-449C-5p調(diào)控主動脈瓣退行性鈣化作用機制的研究.pdf

1、目的:
　　隨著我國風濕熱發(fā)病率下降及老齡化加劇，退行性鈣化性主動脈瓣膜病(DCAVD)成為老年人最常見的心臟瓣膜病。目前DCAVD已成為我國老年人心衰、暈厥甚至猝死的主要病因之一，尚無有效藥物能預(yù)防或延緩其進展，手術(shù)仍是最有效的治療手段，這給患者家庭及社會帶來了巨大經(jīng)濟負擔。探討DCAVD發(fā)病機制，從而及時有效的干預(yù)其進展，將具有極大的經(jīng)濟價值和社會價值。
　　既往認為DCAVD是退行性鈣磷沉積不可逆的被動過程，近年來研究

2、表明DCAVD是類似成骨樣分化受多因素調(diào)控的主動過程，涉及慢性炎癥反應(yīng)、脂代謝異常及鈣鹽沉積等。至今，DCAVD發(fā)病機制仍不清楚，有待進一步研究。
　　Mohler等已分離出瓣膜間質(zhì)細胞(VICs)，并證實其在特定條件下可轉(zhuǎn)化為成骨細胞樣細胞，并形成鈣結(jié)節(jié)。研究證實主動脈鈣化瓣膜中成骨細胞和骨組織的標志物表達升高，如堿性磷酸酶、骨鈣蛋白、骨橋蛋白等，提示鈣化相關(guān)因子可能參與DCAVD發(fā)病過程，VICs向成骨細胞分化可能是DCAVD

3、發(fā)病的重要基礎(chǔ)。microRNAs是細胞內(nèi)重要的非編碼調(diào)控分子，可參與調(diào)控多種生理和病理過程。VICs結(jié)合miRNA是研究DCAVD發(fā)病機制的一個新視角，存在為DCAVD提供早期診斷及治療的潛在價值。
　　本研究采用miRNA芯片技術(shù)篩選出調(diào)控DCAVD相關(guān)的miRNAs，從中選取miRNA-449c-5p作為研究對象，進一步驗證其功能，通過RT-PCR、Western blot等技術(shù)探討其調(diào)控機制，以期闡明DCAVD發(fā)病機制，尋

4、找其早期診斷及干預(yù)措施。
　　感染性心內(nèi)膜炎(IE)是指心臟內(nèi)膜微生物感染，可伴贅生物形成，近年來發(fā)病率呈上升趨勢。關(guān)于活動期IE手術(shù)時機及效果的選擇目前仍存在爭議，傳統(tǒng)上多傾向于內(nèi)科治療，即手術(shù)多在正規(guī)有效抗感染4-6周，體溫正常，血培養(yǎng)陰性后進行，但在此期間，易發(fā)生心功能不全、栓塞等，病死率較高。本研究擬通過分析活動期IE血培養(yǎng)及藥敏結(jié)果，為合理選擇抗生素提供依據(jù)，并進行長期隨訪，以探討早期手術(shù)療效。
　　方法:

5、　　第一部分
　　1、差異miRNAs篩選及目標miRNA確定:對瓣膜鈣化組織和相對正常組織提取RNA，通過miRNA芯片技術(shù)測定miRNA表達情況，篩選出差異miRNAs，從差異miRNAs中選取miRNA-449c-5p作為研究對象，通過RT-PCR技術(shù)驗證其差異表達。
　　2、VICs培養(yǎng)和鑒定:術(shù)中留取人正常主動脈瓣膜，采用改進的膠原酶消化法獲取VICs，并對VICs進行細胞表型鑒定。
　　3、差異性表達miR

6、NA-449c-5p的功能驗證:將miRNA-449c-5p mimics、inhibitor和negative control分別導(dǎo)入VICs，模擬過表達和低表達miRNA-449c-5p，進行轉(zhuǎn)染效率測定，然后進行成骨誘導(dǎo)，在7天和14天進行RT-PCR、Western blot、ALP活性測定及茜素紅染色，驗證miRNA-449c-5p對VICs成骨分化的影響。
　　4、miRNA-449c-5p調(diào)控VICs成骨分化的機制:

7、通過miRNA專業(yè)靶基因預(yù)測網(wǎng)站，初步預(yù)測miRNA-449c-5p靶基因，再通過雙熒光素酶實驗，驗證兩者結(jié)構(gòu)匹配程度，最后通過SiRNA技術(shù)驗證靶基因的真實性。
　　5、VICs成骨誘導(dǎo)中，IL-6對miRNA-449c-5p的調(diào)控作用:首先，收集VICs成骨誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后24h、48h的培養(yǎng)基，檢測其IL-6濃度;其次，VICs培養(yǎng)基中，加入IL-6對其刺激，分別于加入前和加入后24h、48h收集細胞，行miRNA-449c-

8、5p測定。
　　6、動物實驗:將miRNA-449c-5p agomirs、antagomirs及negative control分別經(jīng)尾靜脈注射入Balb/c小鼠體內(nèi)，分別過表達和低表達miRNA-449c-5p，然后皮下注射Vitamin D3誘導(dǎo)軟組織鈣化，6周后行心臟超聲檢測。
　　第二部分
　　回顧性分析2010年5月至2014年7月我院收治的62例活動期IE患者血培養(yǎng)結(jié)果及臨床資料，所有患者均早期外科治療，

9、術(shù)后長期隨訪。
　　結(jié)果:
　　1、成功篩選出DCAVD相關(guān)的差異miRNAs，并從中選取miRNA-449c-5p作為研究對象;
　　2、成功分離出VICs，并對其表型進行了鑒定，證實其達到體外實驗要求;
　　3、對miRNA-449c-5p進行功能研究，動物水平、細胞水平、蛋白水平和mRNA水平研究顯示，miRNA-449c-5p能夠調(diào)控VICs成骨分化;
　　4、通過靶基因?qū)I(yè)預(yù)測網(wǎng)站，預(yù)測miRNA

10、-449c-5p靶基因為Smad4，通過雙熒光素酶報告實驗，確定Smad4為其靶基因，最終確定miRNA-449c-5p通過TGF-β/Smad通路調(diào)控VICs成骨分化;
　　5、證實VICs成骨分化中，分泌型IL-6表達上調(diào)，而IL-6刺激VICs可導(dǎo)致其miRNA-449c-5p表達下調(diào)，從而證實DCAVD發(fā)病中IL-6可能調(diào)控miRNA-449c-5p的表達;
　　6、活動期IE主要病原菌為鏈球菌、糞腸球菌和金葡菌，圍