循環(huán)血microRNAs作為抗血小板藥物抵抗的標志物研究.pdf

1、隨著社會的發(fā)展，冠心病逐漸成為危害人類健康的重要疾病之一，以支架植入為主的介入治療成為治療冠心病的重要手段，而介入治療術后阿司匹林+氯吡格雷為基礎的雙聯(lián)抗血小板治療成為治療冠心病的重要基石。但有研究顯示，即使經(jīng)過充分的抗血小板治療，仍有3-30％服用氯吡格雷的患者不能達到理想的抗血小板作用，可能存在抗血小板藥物抵抗，導致支架內再狹窄等原因引起的心血管不良事件發(fā)生。抗血小板藥物抵抗的檢測手段多樣，主要有LTA(Light transmis

2、sionaggregation)、VASP(Vaso dolator-stimulated phosphoprotein)、VerifyNow以及血栓彈力圖等，目前這些在國內應用于臨床的很少。microRNAs(miRNAs)是長度為18-20bp的細胞內源性的非編碼小分子RNA，通過與靶基因結合發(fā)揮作用，在轉錄后水平調控基因表達。近年來，miRNAs作為各種疾病狀態(tài)標志物的研究越來越受到關注。
　　研究目的:確定循環(huán)血中可作為抗

3、血小板藥物抵抗標志物的microRNAs，以期指導臨床個體化藥物治療方案。
　　研究方法:入組冠心病支架術后發(fā)生心肌梗死再次冠脈造影明確為支架內再狹窄的患者，符合入選標準和排除標準，術前阿司匹林300mg/d，口服氯吡格雷300mg后24h，或者600mg后6h，或者阿司匹林100mg+氯吡格雷75mg/日＞7d，從肘前靜脈抽取靜脈血A、B、C3管，血液樣本量分別為2ml、2ml、6ml，其中A、B兩管用于VerifyNow檢測儀

4、檢測，確定PRU值，根據(jù)PRU值進行分組，PRU值≥208為血小板低反應組，PRU值＜208為血小板正常反應組。兩組各選取1例血樣本行芯片檢測，初篩出兩組有差異表達的miRNAs，結合既往文獻報道，確定候選miRNAs。對上述第3管靜脈血樣本進行RNA抽提，測定濃度和純度，以線蟲Cel-miR-39為參照物，對候選miRNAs在兩組之間分別進行qRT-PCR進行驗證，確定差異表達的miRNAs，分析其與抗血小板藥物抵抗之間的相關性及診斷

5、價值。然后對血小板低反應組調整藥物治療方案（氯吡格雷雙倍劑量和替格瑞洛），再次經(jīng)VerifyNow檢測儀檢測，部分患者血小板反應性變?yōu)檎７磻?，根?jù)這種情況，分為三組:A組為調整為氯吡格雷加倍劑量前低反應組(n=4)和調整后正常反應組(n=4)，B組為調整為氯吡格雷雙倍劑量前低反應組(n=3)和調整后低反應組(n=3)，C組為調整為替格瑞洛前低反應組(n=13)和調整后正常反應組(n=13)，對三組的患者血漿進行qRT-PCR驗證，明確

6、差異表達的miRNAs。
　　研究結果:(1)根據(jù)VerfyNow檢測值PRU值分為血小板治療低反應組(n=20)和血小板治療正常組(n=27)，基線臨床資料中兩組年齡、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白有顯著差異(P＜0.05)但體重指數(shù)、高血壓比例、糖尿病比例、白細胞計數(shù)、血小板計數(shù)、生化指標、心功能、支架長度和直徑無顯著差異，經(jīng)Logistic回歸分析顯示年齡、紅細胞計數(shù)、血紅蛋白不是抗血小板藥物抵抗獨立影響因素(P＞0.05)。芯片結果

7、顯示兩組之間差異大于2倍的miRNAs共有76種，結合既往文獻報道，確定候選miRNAs有12種:miR-16、miR-223、miR-191、miR-155、miR-146、miR-26a、miR-26b、miR-24、miR-150、miR-126-5p、miR-126-3p、miR-23a。(2)通過qRT-PCR驗證，兩組之間差異表達的miRNAs有四種:miR-223、miR-191、miR-155、miR-146，其中血小板

8、治療低反應組miR-223、miR-191升高，miR-155、miR-146降低，較血小板治療正常反應組差異顯著(P＜0.05)，四種miRNAs聯(lián)合診斷抗血小板藥物抵抗的效能達到92.2％，與PRU值之間呈正相關(r=0.645，P＜0.001)。調整藥物治療方案后，A組結果顯示低反應組中miR-146較正常反應組表達顯著升高(P=0.004);B組結果顯示低反應組和正常反應組miRNAs無顯著變化（P＞0.05）;C組結果顯示低反