TBX21基因啟動(dòng)子rSNP功能鑒定及其與Th1-Th2分化關(guān)系的研究.pdf

1、T-bet是Th1特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，屬T-box蛋白家族成員。T-bet上調(diào)IFN-γ轉(zhuǎn)錄和IL-12Rβ2表達(dá)，提高T細(xì)胞對(duì)IL-12信號(hào)傳遞的敏感性，從而促進(jìn)初始Th細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞[1]。目前已發(fā)現(xiàn)在人體CD4+T細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD8+效應(yīng)T細(xì)胞中表達(dá)T-bet，且與宿主炎癥反應(yīng)、抗病原體免疫應(yīng)答關(guān)系密切[2, 3]。對(duì)孿生子研究還發(fā)現(xiàn)，宿主遺傳因素對(duì)TBX21基因(其編碼T-bet)表達(dá)及其調(diào)控的Th1細(xì)胞分化起主要作用

2、；Th2 應(yīng)答不受遺傳因素影響, 而受T-bet 誘導(dǎo)的Th1應(yīng)答所調(diào)控[4]。
　　 人類基因組中存在廣泛的多態(tài)性，基因組序列的差異構(gòu)成了不同個(gè)體與群體對(duì)疾病的易感性、對(duì)藥物與環(huán)境因子不同反應(yīng)的遺傳基礎(chǔ)。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotidepolymorphism，SNP）是人類基因組中分布廣泛、密度高、易于批量檢測(cè)且相對(duì)穩(wěn)定的第三代遺傳標(biāo)記，在復(fù)雜疾病的基因定位、關(guān)聯(lián)分析、個(gè)體和群體對(duì)環(huán)境致病因子與藥物的易感性

3、研究中得到廣泛應(yīng)用[5]。
　　 啟動(dòng)子核苷酸序列的遺傳變異可導(dǎo)致一些復(fù)雜遺傳疾病關(guān)聯(lián)基因表達(dá)量的改變。
　　 宿主遺傳因素決定的IFN-γ水平降低可促進(jìn)機(jī)體免疫耐受形成。對(duì)TBX21基因外顯子和啟動(dòng)子的掃描顯示，T-1993C SNP為日本人和高加索人群中最常見多態(tài)。T-1993C多態(tài)性與日本人和高加索人群的哮喘發(fā)病有關(guān)[6]，且體外功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)T-1993C 多態(tài)性可影響TBX21基因的轉(zhuǎn)錄活性[7]。我們對(duì)中國(guó)人群

4、的TBX21基因SNP分析顯示，T-1993C 多態(tài)性與慢性HBV 感染[8]、自身免疫性肝炎和系統(tǒng)性紅斑狼瘡關(guān)聯(lián)[9]。這些免疫性疾病發(fā)生可能與免疫耐受的缺失或免疫反應(yīng)受到抑制的分子遺傳機(jī)制有關(guān)。
　　 遺傳關(guān)聯(lián)研究不能說明TBX21基因功能是直接受T-1993C 多態(tài)性影響，還是受與T-1993C SNP 連鎖不平衡的其他多態(tài)性位點(diǎn)影響。為更好地弄清T-bet表達(dá)的調(diào)控機(jī)制及其關(guān)聯(lián)的自身免疫性疾病、變應(yīng)性和感染性疾病的宿主易

5、感性, 本研究采用電泳遷移率分析（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）、染色質(zhì)免疫沉淀分析(chromatin immunoprecipitation, ChIP), 證實(shí)-1993 位點(diǎn)的等位特異性順式調(diào)控作用; 同時(shí), 以健康體檢者外周血為研究對(duì)象, 采用流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)觀察-1993 位點(diǎn)T/C等位變異對(duì)正常人群CD4+T淋巴細(xì)胞TBX21表達(dá)量（蛋白水平）及Th1/Th2 應(yīng)答的

6、影響，以期深入認(rèn)識(shí)TBX21基因調(diào)節(jié)性SNP（regulatory SNP，rSNP）在感染性疾病、自身免疫性疾病及變應(yīng)性疾病中的作用。
　　 1.轉(zhuǎn)錄因子YY1與TBX21基因-1993T/C 位點(diǎn)區(qū)域結(jié)合的確定生物信息分析顯示，TBX21基因啟動(dòng)子-2211至-1712 區(qū)域包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子YY1結(jié)合的保守序列，T-1993C SNP 相鄰YY1結(jié)合的保守序列（AAATGG）。采用-1993T和-1993C等位寡核苷酸探針進(jìn)

7、行競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)顯示，YY1與T和C等位均特異性結(jié)合，但其與C等位親和力明顯高于T等位。T、C等位探針交叉抑制實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，同等濃度時(shí)C等位可以將T等位結(jié)合條帶完全抑制，而T等位卻不能將C等位結(jié)合條帶完全抑制；YY1冷探針可以將T、C等位結(jié)合的慢遷移率結(jié)合帶完全抑制，而突變YY1冷探針則不能抑制慢遷移率結(jié)合帶。采用YY1抗體進(jìn)行超漂移實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與T和C等位結(jié)合的慢遷移率條帶包含轉(zhuǎn)錄因子YY1。同時(shí), 我們利用人CD4+T淋巴細(xì)胞株jur

8、kat 進(jìn)行ChIP分析，進(jìn)一步確定YY1與TBX21基因啟動(dòng)子區(qū)包含-1993位點(diǎn)序列發(fā)生結(jié)合。
　　 2.重慶人群TBX21基因T-1993C 多態(tài)性的分布狀況我們對(duì)收集的370例健康獻(xiàn)血員的全血標(biāo)本基因組DNA 進(jìn)行PCR-限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)分析，結(jié)果顯示：370例標(biāo)本中，-1993TT基因型為279例(76％),-1993TC基因型為86例(23％),-1993CC基因型為5例(1％），-1993T/C等位頻率為13％

9、。
　　 3.-1993T/C基因型與TBX21表達(dá)量和CD4+T細(xì)胞應(yīng)答的關(guān)系在-1993 位點(diǎn)分型標(biāo)本中，我們隨機(jī)選取17例，其中，TT基因型和TC基因型各7例，CC基因型3例。再次采集全血，采用五色流式細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)對(duì)T-bet、IFN-γ
　　 及IL-4水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，T-bet和IFN-γ的表達(dá)量從TT→TC→CC基因型呈遞減趨勢(shì)，而IL-4表達(dá)量則呈遞增趨勢(shì)，且不同基因型個(gè)體的各種因子之間存在顯著差異