微球囊壓迫家兔三叉神經(jīng)節(jié)的病理和生理學(xué)變化及外周血單個(gè)核細(xì)胞移植促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　 三叉神經(jīng)痛(Trigeminal Neuralgia，TN)是屬于功能神經(jīng)外科領(lǐng)域的一種疾病，據(jù)統(tǒng)計(jì)約30％-50％患者因不堪忍受疼痛的痛苦而有自殺傾向。作為一種中老年常見疾病，三叉神經(jīng)痛呈逐年增多趨勢。
　　 近年國內(nèi)外采用三叉神經(jīng)節(jié)及神經(jīng)根位置的治療三叉神經(jīng)痛的方式如:微球囊壓迫技術(shù)(PMC)、射頻熱凝(RF)、半月節(jié)甘油封閉及r-刀等治療雖不同程度的取得了滿意結(jié)果，但上述技術(shù)手段均會造成患者三叉神經(jīng)的

2、功能減退或功能障礙，包括感覺功能及運(yùn)動(dòng)功能?；颊弑憩F(xiàn)為面部麻木、咀嚼無力。個(gè)別麻木癥狀明顯，且伴隨不適癥狀，甚至出現(xiàn)了異常的感覺。此外，顏面部外傷或手術(shù)（如腮腺腫瘤、上下頜骨惡性腫瘤手術(shù)）亦可不同程度的導(dǎo)致三叉神經(jīng)功能障礙。致使病人生活質(zhì)量嚴(yán)重下降，痛苦不堪，而且尚無有效的治療方法。
　　 為適應(yīng)臨床需要，我們以家兔作為實(shí)驗(yàn)對象，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)及參考國外Brown等[12]人的方法研究認(rèn)為，采用壓迫壓力為1005±150mmHg時(shí)，

3、能達(dá)到有選擇性的使得大的有髓神經(jīng)纖維的脫髓鞘改變，而不至于壓力過大造成神經(jīng)不可修復(fù)性損傷。應(yīng)用微球囊壓迫半月節(jié)方法建立家兔三叉神經(jīng)半月節(jié)部位的神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型;研究損傷后神經(jīng)的病理學(xué)變化;從而為神經(jīng)損傷后修復(fù)與再生方法的進(jìn)一步研究建立實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。
　　 臨床上給病人實(shí)施PMC時(shí)會出現(xiàn)三叉神經(jīng)抑制反應(yīng)，表現(xiàn)為心率和血壓的一過性顯著改變，心率下降，嚴(yán)重者心臟停搏，血壓下降后又急劇升高，這種危象嚴(yán)重者危及患者生命安全，已經(jīng)引起了臨床

4、醫(yī)生的高度重視，但具體機(jī)制目前未完全清楚。
　　 本課題以家兔為實(shí)驗(yàn)對象研究家兔PMC術(shù)中是否也會發(fā)生與人類相似的三叉神經(jīng)抑制反應(yīng)，以期望為下一步研究發(fā)生三叉神經(jīng)抑制反應(yīng)的機(jī)理及相應(yīng)的預(yù)防及治療措施建立動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 神經(jīng)系統(tǒng)的再生功能是有限制的，損傷后無有效的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)再生的治療，歸因于巨噬細(xì)胞的浸潤能力弱及膠質(zhì)細(xì)胞瘢痕形成，星形細(xì)胞形成膠質(zhì)瘢痕，成為了神經(jīng)軸突再生的物理屏障，且瘢痕內(nèi)含有神經(jīng)再生抑制因子。<

5、br>　　 外周血單個(gè)核細(xì)胞(MNC)已被研究證實(shí)具有神經(jīng)再生功能，具有更強(qiáng)的吞噬作用。MNC是血管內(nèi)皮祖細(xì)胞的一部分，MNC體外培養(yǎng)增加缺血性腦組織的VEFG，通過血管再生促進(jìn)神經(jīng)再生。被移植的MNC可以分泌多種細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)，作為細(xì)胞因子改善神經(jīng)再生的內(nèi)環(huán)境從而促進(jìn)神經(jīng)再生。
　　 本課題采用球囊壓迫家兔半月節(jié)之后將自體外周血單個(gè)核細(xì)胞移植入半月節(jié)內(nèi)，觀察三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)VEGF表達(dá)及神經(jīng)節(jié)組織

6、內(nèi)血管新生的變化。為單個(gè)核細(xì)胞促進(jìn)神經(jīng)再生及神經(jīng)功能恢復(fù)機(jī)理提供理論依據(jù)，也將為自體外周血單個(gè)核細(xì)胞將來廣泛地應(yīng)用于臨床建立實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。
　　 材料和方法:
　　 一、微球囊壓迫神經(jīng)節(jié)方法建立家兔三叉神經(jīng)損傷模型及損傷后組織學(xué)的改變
　　 1、實(shí)驗(yàn)材料
　　 (1)動(dòng)物:成年健康日本大耳白兔，雌雄不分，體重2.7-3.3Kg
　　 (2)主要試劑:速眠新，蘇醒靈，慶大霉素，Omnipaque造影劑

7、。
　　 (3)主要儀器:No.18薄壁穿刺針，No.2 Fogarty導(dǎo)管，電子天平，石蠟切片機(jī)，萬能顯微鏡，透射電子顯微鏡。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法:
　　 (1)建立家兔三叉神經(jīng)經(jīng)皮微球囊壓迫損傷的動(dòng)物模型
　　 (2)經(jīng)皮穿刺微球囊壓迫家兔三叉神經(jīng)半月節(jié)
　　 (3)三叉神經(jīng)節(jié)H&E染色觀察
　　 (4)三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞直徑測量
　　 (5)三叉神經(jīng)透射電子顯微鏡觀察
　　

8、 二、微球囊壓迫神經(jīng)節(jié)引起家兔三叉神經(jīng)抑制反應(yīng)的研究
　　 1、實(shí)驗(yàn)材料
　　 (1)動(dòng)物:成年健康日本大耳白兔，雌雄不分，體重2.7-3.3Kg
　　 (2)主要試劑:速眠新，蘇醒靈，慶大霉素，Omnipaque造影劑。
　　 (3)主要儀器:No.18薄壁穿刺針，No.2 Fogarty導(dǎo)管，交流Medlab生物信號采集處理系統(tǒng)。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法:
　　 (1)家兔實(shí)施PMC手術(shù)

9、
　　 (2)檢測采集穿刺針刺入卵圓孔、No.2球囊導(dǎo)管進(jìn)入及球囊擴(kuò)張三叉神經(jīng)節(jié)受到壓迫三個(gè)時(shí)期記錄各時(shí)相血壓和心率值。
　　 三、外周血單個(gè)核細(xì)胞移植對三叉神經(jīng)損傷的神經(jīng)修復(fù)與保護(hù)作用初步研究
　　 1、實(shí)驗(yàn)材料
　　 (1)動(dòng)物:成年健康日本大耳白兔，雌雄不分，體重2.7-3.3Kg
　　 (2)主要試劑:二甲苯，生物素化山羊抗兔IgG，CD105，辣根酶標(biāo)記鏈酶親合素，無水乙醇，蘇木精，山羊

10、血清，PKH-26染料，稀釋液C，EDTA，DAPI，pkh26，抗熒光淬滅劑。
　　 (3)主要儀器:電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，-30℃恒冷低溫切片機(jī)，電熱恒溫培養(yǎng)箱，超純水系統(tǒng)，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺，超速冷凍離心機(jī)，激光共聚焦顯微鏡。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法:
　　 (1)兔外周血單核細(xì)胞的分離及PKH-26標(biāo)記
　　 (2)三叉神經(jīng)半月節(jié)PMC損傷后局部單個(gè)核細(xì)胞移植
　　 (3)免疫熒光檢查半月

11、節(jié)切片
　　 (4)免疫組化法觀察神經(jīng)節(jié)細(xì)胞VEGF的表達(dá)及神經(jīng)節(jié)內(nèi)微血管密度
　　 (5)電鏡觀察移植組及對照組髓鞘
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　 一、微球囊壓迫神經(jīng)節(jié)方法建立家兔三叉神經(jīng)損傷模型及損傷后組織學(xué)的改變
　　 1.通過解剖定位、建立了微球囊壓迫半月節(jié)三叉神經(jīng)損傷模型。
　　 2.正常神經(jīng)節(jié)細(xì)胞質(zhì)HE染色被染呈紅色，核深染，形態(tài)規(guī)則，周邊有扁平的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞即衛(wèi)星細(xì)胞包繞。電鏡下正

12、常髓鞘呈同心圓形排列，較規(guī)則，有大的有髓神經(jīng)纖維及小的有髓神經(jīng)纖維，前者髓鞘厚度相對較厚。兔PMC后2周、4周電鏡顯示主要為大的有髓神經(jīng)纖維空泡形成、碎裂、脫髓鞘病變，呈蟲蝕樣改變，髓鞘之同心圓板層結(jié)構(gòu)模糊，板層間隙增寬，松散，扭曲，形狀不規(guī)則。
　　 3.PMC后1天、7天、14天及28天的細(xì)胞實(shí)際直徑組內(nèi)數(shù)據(jù)無顯著性差異(P＞0.05)，組間數(shù)據(jù)亦無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 二、微球囊壓迫神經(jīng)節(jié)引起家兔三叉

13、神經(jīng)抑制反應(yīng)的研究
　　 穿刺針進(jìn)入卵圓孔、No.2球囊導(dǎo)管置入及球囊擴(kuò)張三叉神經(jīng)節(jié)受到壓迫時(shí)兔的心率和平均動(dòng)脈血壓都有明顯的下降（P＜0.01)。而穿刺針插入卵圓孔后心率為293±28bmp、平均動(dòng)脈血壓為76±8mmHg，與穿刺針插入前同一指標(biāo)相比無顯著性差異（分別為P＞0.05和P＞0.05）;球囊導(dǎo)管置入安放到位后兔的心率286±16bpm和平均動(dòng)脈血壓82±12mmHg與球囊導(dǎo)管置入前同一指標(biāo)相比亦無顯著性差異（分別為

14、P＞0.05和P＞0.05）;球囊導(dǎo)管擴(kuò)張前后兔的心率無顯著性差異(P＞0.05)而平均動(dòng)脈血壓有顯著性差異（P＜0.05)。
　　 三、外周血單個(gè)核細(xì)胞移植對三叉神經(jīng)損傷的神經(jīng)修復(fù)與保護(hù)作用初步研究
　　 1.外周血單個(gè)核細(xì)胞半月節(jié)移植后1天，顯微鏡下可以觀察到被PKH-6標(biāo)記的單個(gè)核細(xì)胞，呈紅色;7天后，仍能觀察到PKH-26標(biāo)記的單個(gè)核細(xì)胞，但數(shù)量減少;14天后幾乎觀察不到紅色的PKH-26標(biāo)記的單個(gè)核細(xì)胞。

15、>　　 2.正常對照組VEGF多為陰性表達(dá)，少數(shù)有較弱的陽性表達(dá);壓迫組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及軸突中均有VEGF陽性表達(dá)，VEGF多表達(dá)于細(xì)胞漿中，神經(jīng)纖維脫髓鞘，染色質(zhì)聚邊、核濃染現(xiàn)象;MNCs移植組神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及軸突中VEGF陽性表達(dá)呈強(qiáng)陽性。
　　 3.與正常細(xì)胞體，對照組及移植組的三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的灰度值均較正常組低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);移植組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的灰度值均較對照組更低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);對照組及移植組組

16、內(nèi)7天及14天灰度值無明顯差別(P＞0.05)，但28天時(shí)均升高(P＜0.05)。
　　 4.對照組及移植組在7天、14天均有新生血管生成，而移植新生血管增多更明顯，兩組7天新生血管生成達(dá)高峰，14d新生血管生成開始減少，但移植組14天時(shí)可以觀察到新生成的血管管腔形成。
　　 5.與壓迫組相比，移植組7天及14天三叉神經(jīng)的脫髓鞘改變更加明顯，14天時(shí)可見成片的神經(jīng)脫髓鞘改變，程度劇烈，可見到單核細(xì)胞浸潤吞噬髓鞘碎片，28

17、天兩組無明顯區(qū)別。
　　 結(jié)論:
　　 1.微球囊壓迫半月節(jié)方法可以制作三叉神經(jīng)損傷的動(dòng)物模型，為神經(jīng)損傷后促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)與再生的進(jìn)一步研究建立了實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)。
　　 2.三叉神經(jīng)微球囊壓迫后不同時(shí)間呈現(xiàn)不同程度的神經(jīng)脫髓鞘的改變，而神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的直徑無明顯變化，為神經(jīng)再生及修復(fù)提供支持。
　　 3.經(jīng)皮穿刺微球囊壓迫家兔三叉神經(jīng)半月節(jié)能引起與人類相似的三叉神經(jīng)抑制反應(yīng)。家兔可以作為研究經(jīng)皮穿刺微球囊壓迫治療三