長鏈非編碼RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌中的表達(dá)及其對肺腺癌A549細(xì)胞惡性生物學(xué)表型和化療耐藥性的影響.pdf

1、目的:腫瘤特別是惡性腫瘤是世界范圍內(nèi)人類死亡的主要原因之一，嚴(yán)重危害了人類的健康。近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升，對人類健康的危害日漸嚴(yán)重。肺癌是最常見的呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤，在我國乃至全球范圍是發(fā)病率和死亡率均居首位的惡性腫瘤，其中肺腺癌占40％以上。肺腺癌患者多數(shù)在初診時(shí)即已是晚期并發(fā)生轉(zhuǎn)移，預(yù)后不佳。目前肺腺癌主要的治療策略仍是手術(shù)切除和術(shù)后放射及化學(xué)藥物治療。盡管近年來的治療手段日益發(fā)展，但肺腺癌的5年生存率仍不能令人滿意

2、。因此，深入研究肺腺癌的病因?qū)W及新的治療手段尤為迫切。
　　手術(shù)治療是目前肺腺癌的首選治療手段，圍手術(shù)期的化療亦是肺腺癌的重要治療手段，是手術(shù)治療的有效補(bǔ)充。但是在臨床上，近70％的肺癌患者在就診時(shí)就已經(jīng)處于局部晚期或者發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，在此種情況下，化療和放療成為大多數(shù)患者首選的治療方案。然而在化療過程中產(chǎn)生的化療耐藥降低了化療的效果，限制了化療的臨床應(yīng)用。因此，加強(qiáng)對肺癌特別是肺腺癌化療耐藥分子機(jī)制的研究顯得尤為迫切。
　　

3、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200個(gè)堿基的非編碼RNA，是近期分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)，其在腫瘤病因?qū)W的研究也日益受到重視，相關(guān)報(bào)道日益增多，對長鏈非編碼RNA的功能及分子機(jī)制的研究逐漸深入。長鏈非編碼RNA可以在表觀遺傳調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多種層面上調(diào)控下游的功能基因的表達(dá)水平，能夠參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞自噬性死亡等的調(diào)節(jié)，進(jìn)而發(fā)揮其生物學(xué)作用。已

4、有研究表明在腫瘤細(xì)胞中，某些特定的長鏈非編碼RNA的表達(dá)水平會(huì)發(fā)生明顯改變，提示特定的長鏈非編碼RNA可能與該腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。腫瘤中差異表達(dá)長鏈非編碼RNA已經(jīng)為腫瘤的診斷和治療提供了新的方向。隨著研究不斷深入，長鏈非編碼RNA在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中的作用以及調(diào)控基因的方式等的研究成果將為腫瘤的臨床診斷和預(yù)后標(biāo)志物的研究以及研發(fā)新的以長鏈非編碼RNA為治療靶點(diǎn)的治療手段解開新的篇章。
　　同時(shí)越來越多的研究還證實(shí)長鏈非編碼RNA

5、參與了眾多腫瘤的化療耐藥過程，其中包括肺腺癌。例如，長鏈非編碼RNA-HOTAIR能夠通過沉默p21蛋白誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性。H19敲除能夠降低肺腺癌細(xì)胞對順鉑的反應(yīng)性，高表達(dá)H19的肺腺癌患者的預(yù)后更差，順鉑化療的效果不佳。
　　長鏈非編碼RNA KCNQ1重疊轉(zhuǎn)錄物1(KCNQ1 Opposite Strand/AntisenseTranscript1，KCNQ1OT1)定位11p15.5，近期研究發(fā)現(xiàn)其在結(jié)直腸癌中

6、存在表達(dá)及功能異常。而其在肺腺癌中的功能和分子機(jī)制及其與化療耐藥的關(guān)系迄今無深入的研究。在前期工作中，我們應(yīng)用長鏈非編碼RNA芯片篩查發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌中存在顯著的高表達(dá)，提示KCNQ1OT1可能參與了肺腺癌的發(fā)生發(fā)展?；趯﹂L鏈非編碼RNA芯片結(jié)果的深入分析還發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1與MDR1基因存在顯著的正相關(guān)，而MDR1參與化療耐藥的形成已被學(xué)者明確證實(shí)，提示KCNQ1OT1可能與肺腺癌的化療耐藥相關(guān)。因此

7、我們開展如下深入的研究。
　　本研究擬檢測長鏈非編碼RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)，并研究KCNQ1OT1對肺腺癌A549細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、凋亡和侵襲等細(xì)胞生物學(xué)表型的調(diào)節(jié)作用，以及其對肺腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞A549/PA細(xì)胞化療耐藥性的調(diào)節(jié)作用。
　　研究方法:
　　1、TRIZOL法提取76例手術(shù)切除的肺腺癌組織及相應(yīng)的癌旁組織的總RNA。實(shí)時(shí)定量PCR(qRT-PCR)檢測其中KCNQ1OT

8、1的表達(dá)。
　　2、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析明確KCNQ1OT1表達(dá)與肺腺癌患者的瘤體大小、分化程度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理信息的相關(guān)性。
　　3、實(shí)時(shí)定量PCR檢測正常支氣管上皮16HBE細(xì)胞與肺腺癌A549細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)。
　　4、應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默A549細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證沉默效果。
　　5、MTT法檢測KCNQ1OT1沉默對A549細(xì)胞增殖能力的調(diào)節(jié)作用。

9、r>　　6、PI單標(biāo)流式細(xì)胞法檢測KCNQ1OT1沉默對A549細(xì)胞細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)作用。
　　7、雙標(biāo)流式細(xì)胞法檢測KCNQ1OT1沉默對A549細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)作用。
　　8、Transwell法檢測KCNQ1OT1沉默對A549細(xì)胞的侵襲能力的調(diào)節(jié)作用。
　　9、選取應(yīng)用紫杉醇方案化療的41例肺腺癌患者，參照RECIST療效評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)將其分為化療敏感組（16例）和化療非敏感組（25例），實(shí)時(shí)定量PCR檢測兩組中KCNQ

10、1OT1的表達(dá)。
　　10、獲取對紫杉醇耐藥的A549/PA細(xì)胞，檢測A549/PA細(xì)胞對紫杉醇的半抑制濃度(IC50)，明確其對紫杉醇的耐藥性。
　　11、實(shí)時(shí)定量PCR檢測A549細(xì)胞及A549/PA細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)。
　　12、應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默A549/PA細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證沉默效果。
　　13、 MTT法檢測KCNQ1OT1沉默的A549/PA細(xì)胞對紫杉醇的

11、半抑制濃度。
　　14、Western Blot法檢測KCNQ1OT1沉默的A549/PA細(xì)胞中多藥耐受蛋白1(MDR1)的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1、芯片篩查肺腺癌中表達(dá)異常的長鏈非編碼RNA
　　長鏈非編碼RNA芯片篩查顯示，長鏈非編碼RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌組織中的表達(dá)顯著上調(diào)。
　　2、肺腺癌組織及A549細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)
　　實(shí)時(shí)定量PCR檢測76例手術(shù)切除的肺腺癌組織及

12、A549細(xì)胞中的KCNQ1OT1表達(dá)。結(jié)果顯示，與癌旁正常組織相比，肺腺癌組織中KCNQ1OT1表達(dá)明顯增加;與對照的16HBE細(xì)胞相比，A549細(xì)胞中KCNQ1OT1表達(dá)顯著增加。
　　3、 KCNQ1OT1表達(dá)與肺腺癌患者臨床病理信息的相關(guān)分析
　　KCNQ1OT1的表達(dá)與肺腺癌的分化程度及病理分期相關(guān)。隨著腫瘤體積的增大、分化程度的降低、TNM分期的增加以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，肺腺癌中KCNQ1OT1的表達(dá)明顯增高。

13、r>　　4、 KCNQ1OT1表達(dá)沉默對A549細(xì)胞惡性表型的調(diào)節(jié)作用
　　實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染si-KCNQ1OT1能夠顯著抑制A549細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)。KCNQ1OT1沉默能夠顯著抑制A549細(xì)胞的增殖活力和侵襲能力，阻滯A549細(xì)胞于G0/G1期，并誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。KCNQ1OT1沉默能夠顯著地抑制A549細(xì)胞的惡性生物學(xué)表型。
　　5、 KCNQ1OT1在紫杉醇化療敏感肺腺癌組織及紫杉

14、化療非醇敏感肺腺癌組織中的表達(dá)
　　實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示，與化療敏感組相比，化療非敏感組肺腺癌組織中KCNQ1OT1表達(dá)顯著增加。
　　6、紫杉醇耐藥細(xì)胞系A(chǔ)549/PA的驗(yàn)證
　　對獲得耐紫杉醇細(xì)胞系A(chǔ)549/PA進(jìn)行檢驗(yàn)，結(jié)果顯示A549/PA細(xì)胞對紫杉醇的耐受性大幅度提高，存活率增加。
　　7、 KCNQ1OT1在A549細(xì)胞及A549/PA細(xì)胞中的表達(dá)
　　實(shí)時(shí)定量PCR檢測A549細(xì)胞及A5

15、49/PA細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)。結(jié)果顯示，與A549細(xì)胞相比，A549/PA細(xì)胞中KCNQ1OT1表達(dá)顯著增加。
　　8、 KCNQ1OT1表達(dá)沉默對A549/PA細(xì)胞的紫杉醇化療耐藥性的調(diào)節(jié)作用
　　實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染si-KCNQ1OT1能夠顯著抑制A549/PA細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)。KCNQ1OT1沉默能夠顯著降低A549/PA細(xì)胞對紫杉醇的IC50值，抑制A549/PA細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性

16、，并顯著降低MDR1蛋白在A549/PA細(xì)胞中的表達(dá)。
　　討論:
　　我們前期的長鏈非編碼RNA芯片篩查中發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在5例肺腺癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)。然后，我們應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測了76例肺腺癌組織，大樣本組織表達(dá)檢測證實(shí)了KCNQ1OT1在肺腺癌中確實(shí)存在顯著的表達(dá)上調(diào)。這與李靜等在非小細(xì)胞肺癌中的研究結(jié)果相符，他們發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1在89例非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)水平明顯增高。這初步證實(shí)KCNQ1OT1的表達(dá)

17、異常可能與肺腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。
　　為了進(jìn)一步明確KCNQ1OT1與肺腺癌的相關(guān)性，我們運(yùn)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析了KCNQ1OT1表達(dá)與肺腺癌患者的臨床病理信息的相關(guān)性。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，KCNQ1OT1的表達(dá)與多種肺腺癌的臨床病理信息相關(guān)，隨著肺腺癌腫瘤體積的增大、分化程度的降低、TNM分期的增加以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)，肺腺癌中KCNQ1OT1的表達(dá)明顯增高。這進(jìn)一步提示KCNQ1OT1與肺腺癌密切相關(guān)，可能在肺腺癌的進(jìn)展和侵襲轉(zhuǎn)移中

18、發(fā)揮作用。
　　KCNQ1OT1在肺腺癌中的功能尚不清楚，亦無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。為此，我們應(yīng)用RNA干擾技術(shù)沉默了肺腺癌A549細(xì)胞中的KCNQ1OT1表達(dá)，并檢測其表達(dá)沉默對A549細(xì)胞的增殖、細(xì)胞凋亡及侵襲能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1沉默能夠顯著抑制A549細(xì)胞的增殖活力和侵襲能力，阻滯A549細(xì)胞于G0/G1期，并誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生凋亡。KCNQ1OT1沉默能夠顯著地抑制A549細(xì)胞的惡性生物學(xué)表型，在肺腺癌中發(fā)

19、揮腫瘤促進(jìn)作用，可能成為肺腺癌潛在的癌基因。
　　化療能夠在一定程度上抑制肺腺癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，改善患者的預(yù)后。然而在化療過程中產(chǎn)生的化療耐藥降低了化療的效果，限制了化療的臨床應(yīng)用。我們對KCNQ1OT1在肺腺癌組織中的表達(dá)情況進(jìn)行深入的分析發(fā)現(xiàn)，KCNQ1OT1在對紫杉醇化療不敏感的肺腺癌患者的瘤體組織中的表達(dá)顯著上調(diào)，提示KCNQ1OT1可能參與肺腺癌的化療耐藥的發(fā)生。而且， KCNQ1OT1在對紫杉醇耐藥的肺腺癌A549/PA

20、細(xì)胞中的表達(dá)較其在A549細(xì)胞中的表達(dá)顯著增高，進(jìn)一步證實(shí)其表達(dá)異常可能與肺腺癌的化療耐藥相關(guān)。然后，我們沉默了A549/PA細(xì)胞中KCNQ1OT1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)KCNQ1OT1沉默能夠顯著降低A549/PA細(xì)胞對紫杉醇的IC50值，抑制A549/PA細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性。我們認(rèn)為KCNQ1OT1參與了肺腺癌細(xì)胞化療耐藥的形成，沉默其表達(dá)能夠顯著抑制肺腺癌耐藥細(xì)胞對紫杉醇的耐藥性，KCNQ1OT1可能會(huì)成為肺腺癌新的治療靶點(diǎn)。
　　

21、Gene Ontology(GO)分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析的結(jié)果顯示KCNQ1OT1與MDR1基因存在顯著的正相關(guān)。MDR1基因是目前已經(jīng)明確的腫瘤化療耐藥相關(guān)基因，其編碼的蛋白是位于細(xì)胞上的重要的ATP依賴的流出泵，其能夠?qū)⒒熕幬镌谄涞竭_(dá)細(xì)胞質(zhì)之前泵出細(xì)胞，阻止化療藥物發(fā)揮抗腫瘤作用。KCNQ1OT1沉默能夠顯著降低MDR1蛋白在A549/PA細(xì)胞中的表達(dá)。

22、因此，我們推測KCNQ1OT1能夠通過正性調(diào)節(jié)MDR1基因的表達(dá)，參與肺腺癌紫杉醇耐藥的形成。
　　上述研究結(jié)果說明KCNQ1OT1能夠通過調(diào)節(jié)MDR1基因的表達(dá)，參與肺腺癌紫杉醇耐藥的形成，可能是肺腺癌潛在的癌基因。上述研究成果為研究肺腺癌化療耐藥發(fā)生的分子機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，進(jìn)一步的研究將為明確肺腺癌的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。
　　結(jié)論:
　　1.長鏈非編碼RNA-KCNQ1OT1在肺腺癌中表達(dá)顯著上調(diào)，且與肺腺