口腔扁平苔蘚與NF-κB相關(guān)細(xì)胞因子和幽門螺桿菌關(guān)系的研究及藥物對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞增殖作用的影響.pdf

1、第一部分：口腔扁平苔蘚與NF‐κB相關(guān)細(xì)胞因子和幽門螺桿菌關(guān)系的研究
　　目的：口腔扁平苔蘚(Oral lichen planus OLP)是一種與自身免疫相關(guān)常見口腔疾病，目前為止OLP病因機(jī)制尚未完全明確。近年來核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactor-KB NF-κB)引導(dǎo)的炎癥通路及其介導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的紊亂一直成為研究的熱點(diǎn)。NF-κB可能通過引起細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)紊亂，進(jìn)一步介導(dǎo)炎癥反應(yīng)參與口腔扁平苔蘚疾病的發(fā)生。
　

2、　楊鳳英等采用基因芯片技術(shù)篩選出與OLP關(guān)系最密切的是幽門螺桿菌感染上皮細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)通路 ECS-HP（Epithelial cell signaling in Helicobacter pylori infection）[1]，口腔中幽門螺桿菌（Helicobacter pylori HP）感染與口腔扁平苔蘚疾病的發(fā)生存在密切關(guān)系，HP也與慢性胃炎、消化性潰瘍、胃黏膜相關(guān)淋巴組織淋巴瘤、胃癌的發(fā)病密切相關(guān)。HP感染胃壁粘膜后可以激活N

3、F-κB通路并介導(dǎo)炎癥反應(yīng)?？谇徽衬づc胃壁粘膜均來自于外胚層，口腔黏膜感染HP后引起的炎癥機(jī)制可能與胃壁粘膜一致?？谇恢蠬P感染激活NF-κB炎癥通路在OLP發(fā)病中的作用有待進(jìn)一步研究。
　　本研究采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA），檢測(cè)口腔扁平苔蘚患者與健康者血清、唾液中IL-8、RANTES的蛋白水平變化，通過觀察血清和唾液中IL-8、RANTES等炎癥因子的變化水平以及感染幽門螺桿菌OLP患者血清和唾液中細(xì)胞因子變化水平，初

4、步探討NF-κB炎癥通路在口腔扁平苔蘚發(fā)病中的作用機(jī)制以及OLP與HP的關(guān)系。
　　方法：
　　1.采用ELISA方法對(duì)口腔扁平苔蘚患者和健康者血清、唾液中IL-8、RANTES的含量進(jìn)行測(cè)定，分析IL-8、RANTES在血清、唾液中表達(dá)。
　　病例納入標(biāo)準(zhǔn)：口腔扁平苔蘚患者30例（糜爛型14例，普通型16例）和健康志愿者30例，分別收集口腔扁平苔蘚患者和健康志愿者的唾液、血清樣本。
　　2.采用ELISA方法檢

5、測(cè)HP感染陽性及HP陰性的口腔扁平苔蘚患者血清、唾液中IL-8、RANTES的表達(dá)，分析HP感染與 NF-κB通路在口腔扁平苔蘚發(fā)病中的關(guān)系及其關(guān)鍵因子的表達(dá)。
　　3.幽門螺桿菌感染檢測(cè)：快速尿素酶試驗(yàn)法檢測(cè)口腔扁平苔蘚患者牙菌斑中的幽門螺桿菌，探討OLP患者和HP感染的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1.口腔扁平苔蘚患者與對(duì)照組相比血清和唾液中IL-8、RANTES顯著增高，P<0.05，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；
　　2

6、.口腔扁平苔蘚血清中糜爛型與普通型IL-8、RANTES細(xì)胞因子表達(dá)水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05，口腔扁平苔蘚唾液中糜爛型IL-8含量較普通型扁平苔蘚顯著升高，P<0.05；
　　3.將口腔扁平苔蘚分為HP感染陽性和HP感染陰性，血清中HP感染陽性較HP感染陰性者IL-8、RANTES表達(dá)水平顯著增高，P<0.05。唾液中HP感染陽性較HP感染陰性者IL-8、RANTES表達(dá)水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。
　　結(jié)

7、論：
　　1.口腔扁平苔蘚患者血清和唾液中IL-8、RANTES細(xì)胞因子水平與對(duì)照組相比均有不同程度的升高，提示口腔扁平苔蘚的發(fā)病可能與NF‐κB通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)，阻斷NF‐κB炎癥通路的激活可能成為治療口腔扁平苔蘚新的靶點(diǎn)，為口腔扁平苔蘚的治療提供新思路與方法。
　　2.血清中HP感染陽性較HP感染陰性者IL-8、RANTES表達(dá)水平顯著增高，提示口腔扁平苔蘚的發(fā)病可能與口腔中HP感染有一定相關(guān)性，并進(jìn)一步介導(dǎo)免疫炎

8、癥反應(yīng)。
　　第二部分：藥物對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞增殖作用的影響
　　目的：目前藥物性牙齦增生的機(jī)制尚未完全明確。一些研究表明牙齦炎、牙周炎菌斑的刺激可能有助于牙齦增生發(fā)展。本課題利用健康人牙齦組織原代培養(yǎng)牙齦成纖維細(xì)胞，分別應(yīng)用硝苯地平、IL-1以及兩種藥物共同干預(yù)牙齦成纖維細(xì)胞，觀察不同藥物對(duì)牙齦成纖維細(xì)胞的增殖活性的影響，進(jìn)一步探討藥物性牙齦增生機(jī)制以及藥物性牙齦增生與牙齦炎的關(guān)系，為臨床上藥物性牙齦增生治療提供新的思路。<

9、br>　　方法：
　　1.牙齦成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)：按照原代細(xì)胞組織塊培養(yǎng)方法，將牙齦組織塊接種于25mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，觀察原代細(xì)胞游出狀態(tài)。細(xì)胞爬滿瓶底約80％時(shí)進(jìn)行傳代。使用0.25％胰酶消化傳代培養(yǎng)，首次傳代按1:1的比例，再次傳代以1:3的比例進(jìn)行。取第5代牙齦成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。其余細(xì)胞凍存?zhèn)溆谩?br>　　2.牙齦成纖維細(xì)胞鑒定：倒置顯微鏡下觀察原代細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；光鏡下觀察原代細(xì)胞HE染色及免疫組化結(jié)果（抗波形蛋白、抗

10、角蛋白）。
　　3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：采用甲基噻唑基四唑(methyl thiazolyltetrazolium， MTT)法測(cè)定不同條件培養(yǎng)液下細(xì)胞數(shù)量變化（A組為空白對(duì)照組，不加任何藥物；B組為硝苯地平組，又分為3個(gè)濃度亞組，B1組加入硝苯地平1200μg/L，B2組加入硝苯地平360μg/L，B3組加入硝苯地平108μg/L；C組為IL-1組，加入IL-1β10ng/ml；D組為硝苯地平+IL-1組，分為3個(gè)亞組，D1組=B1組

11、+C組，D2組=B2組+C組，D3組=B3組+C組），在酶聯(lián)免疫儀上測(cè)定490 nm處各孔吸光度值(OD值)。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。利用SPSS21.0軟件分析數(shù)據(jù)。
　　結(jié)果：
　　1.原代培養(yǎng)細(xì)胞從組織塊游離出的時(shí)間約為10天，倒置顯微鏡鏡下觀察可見散在的貼壁伸展細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈長(zhǎng)梭形，第11天組織塊周圍細(xì)胞明顯增多，組織塊周圍形成細(xì)胞生長(zhǎng)暈形態(tài)。原代第12天，可見細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，胞核圓形或卵圓形，細(xì)胞數(shù)量明顯增多。約12-14

12、天細(xì)胞逐漸融合；
　　2.牙齦成纖維細(xì)胞鑒定：經(jīng)傳代培養(yǎng)后牙齦成纖維細(xì)胞形態(tài)逐漸向典型的成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，細(xì)胞生長(zhǎng)呈漩禍狀或放射走行，有極性且排列緊密，突起變短，呈長(zhǎng)梭形、紡綞形、不規(guī)則三角形態(tài)(見Fig.1)。HE染色示細(xì)胞呈梭形或不規(guī)則三角形態(tài)，核圓或卵圓，胞核內(nèi)可見分裂象，胞漿粉紅，胞核藍(lán)染(見Fig.2)。光鏡下觀察細(xì)胞免疫組織化學(xué)染色，波形蛋白表達(dá)為強(qiáng)陽性，呈棕黃著色，定位于細(xì)胞的胞質(zhì)中，陽性顆粒在胞質(zhì)內(nèi)分布均勻，細(xì)胞核

13、內(nèi)染色陰性，細(xì)胞外未見陽性表達(dá)，細(xì)胞核經(jīng)蘇木精復(fù)染為藍(lán)色，說明細(xì)胞來源于外胚間充質(zhì)(見Fig.3)，對(duì)照組細(xì)胞染色陰性。角蛋白表達(dá)為陰性(見Fig.4)；
　　3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：不同濃度培養(yǎng)液作用后細(xì)胞增殖結(jié)果：培養(yǎng)0h、24h、48h、72h、96h各組OD值變化見Table1。
　　結(jié)論：
　　1.原代培養(yǎng)的細(xì)胞抗波形蛋白表達(dá)陽性、抗角蛋白表達(dá)陰性以及形態(tài)學(xué)上觀察結(jié)果符合牙齦成纖維細(xì)胞，保留此細(xì)胞株，以便用于今后實(shí)