GATA-4基因促進(jìn)5-氮雜胞苷誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向心肌分化.pdf

1、目的:全世界每年都有數(shù)以萬計(jì)的患者被診斷為“充血性心力衰竭(CHF)”[1],其中很大部分是由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化和心肌梗塞造成的,因此缺血性心臟病己成為危害人類健康的最主要疾病。人們普遍認(rèn)為,成熟的心肌細(xì)胞是終末分化細(xì)胞,一旦損傷壞死后不能再生,心肌梗死(MI)后,即使通過一些臨床治療能夠改善心肌缺血的癥狀,卻不能逆轉(zhuǎn)心肌細(xì)胞的壞死,最終將導(dǎo)致充血性心力衰竭的發(fā)生。而成體心臟中的心肌干細(xì)胞數(shù)量極少,起不到修復(fù)的作用;加上心臟移植療法供體稀

2、缺、免疫源性高和費(fèi)用昂貴的限制,因此,現(xiàn)在許多研究者把目光投向干細(xì)胞移植治療技術(shù)。大量研究表明,可以通過細(xì)胞移植術(shù),使干細(xì)胞在瘢痕組織內(nèi)分化成為有功能的心肌細(xì)胞來替代壞死的心肌,進(jìn)而改善心功能。但是關(guān)于細(xì)胞移植還存在許多難題,首先就是用于移植的干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化效率低,達(dá)不到臨床移植所需的數(shù)量。因此研究干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化時(shí)的具體機(jī)制是極具意義的一項(xiàng)課題。
　　 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchyma

3、l Stem Cells,BMSCs)易于從自體獲取,回植后不會(huì)發(fā)生免疫排斥反應(yīng);在體外易進(jìn)行分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增,并可長時(shí)間在體外保持未分化狀態(tài),具有多向分化潛能:其在特定的條件下可向肌腱細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等方向分化,且體外易進(jìn)行外源性基因加工,因此BMSCs是組織工程中較為理想的種子細(xì)胞。
　　 眾多學(xué)者認(rèn)為,心肌分化的過程始于某個(gè)或某些關(guān)鍵基因的啟動(dòng),這些基因活化后的蛋白產(chǎn)物,即轉(zhuǎn)錄因子可以使下游相應(yīng)的靶基因呈級(jí)聯(lián)式地激活

4、,直至分化完成。其中,GATA-4被認(rèn)為和心臟發(fā)育尤為密切。它開始表達(dá)于心臟早期,參與心臟前體細(xì)胞的分化,房室分隔,心臟的環(huán)化,傳導(dǎo)系統(tǒng)的發(fā)育及成熟心臟正常功能的維持。研究表明,GATA-4可能是通過其鋅指結(jié)構(gòu)與Nkx2-5、TBX5、dHAND和MEF2等心臟特異性的轉(zhuǎn)錄因子相互作用形成復(fù)合物,發(fā)揮調(diào)節(jié)作用?；蛲ㄟ^調(diào)控包括心臟肌球蛋白重鏈-α(α-myosin heavy chain,α-MHC)、心肌鈣蛋白C(cardiac tro

5、ponin C,cTnC)、心房利鈉肽(atrial natriureticp eptide,ANP)和腦利鈉肽(brain natriureticp ep tide,BNP)等在內(nèi)的心臟結(jié)構(gòu)基因的表達(dá),發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。GATA-4缺失或突變可引起心血管系統(tǒng)發(fā)育的異常。GATA-4能夠阻止藥物誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生并能夠降低藥物引起的心肌毒性,因此它對(duì)心肌細(xì)胞的正常存活也有一定的作用。
　　 細(xì)胞穿透肽(cell-penet

6、rating protein,CPP),是一種已被證實(shí)能夠通過蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法穿透細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞核,并且能夠保留其生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)。在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中,CPP已成功地幫助蛋白質(zhì)、多肽、DNA和siRNA等大分子生物活性物質(zhì)傳遞到細(xì)胞內(nèi),VP22即為CPP中的一種。由于CPP不受細(xì)胞種類的限制,并且傳遞效率高,因此CPP常用于在不同組織間傳遞大分子量的生物活性蛋白。研究表明,CPP的作用機(jī)制可能為,CPP擁有強(qiáng)大的陽離子特性(這是CPP

7、必備的特征),使其對(duì)富含陰離子的細(xì)胞膜及核苷酸有強(qiáng)大的粘附作用,使其能夠穿透細(xì)胞膜并凝集在細(xì)胞核中。迄今為止,CPP是唯一一種成功地在細(xì)胞間傳遞嵌合蛋白質(zhì)的方法。由于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法缺少靶向作用及低轉(zhuǎn)化率,我們嘗試借助VP22穿透肽的載體作用幫助GATA-4轉(zhuǎn)染至BMSCs中。
　　 因此,本研究擬借助細(xì)胞穿透肽VP22的載體作用,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將GATA-4基因瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,觀察其在誘導(dǎo)劑5-氮雜胞苷(5-a

8、zacytidine,5-aza)的作用下向心肌分化的情況,并與單純經(jīng)5-aZa誘導(dǎo)后的BMSCs向心肌細(xì)胞分化的情況作比較,以試圖闡明心肌細(xì)胞分化過程中的一些規(guī)律,為干細(xì)胞能夠有效轉(zhuǎn)化為心肌細(xì)胞提供策略。
　　 方法:
　　 1 pVP22-GATA-4/myc-His真核表達(dá)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、鑒定與擴(kuò)增
　　 由美國Marc Penn博士惠贈(zèng)的pVP22-GATA-4/myc-His質(zhì)粒,經(jīng)常規(guī)CaCl2法轉(zhuǎn)化至大

9、腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)菌,涂布于含氨芐青霉素的固體LB培養(yǎng)基上,37℃倒置培養(yǎng)12～24 h;挑取單個(gè)克隆菌落,進(jìn)行擴(kuò)增。用質(zhì)粒抽提試劑盒提取質(zhì)粒并檢測(cè)濃度,再經(jīng)XbaI、EcoRI雙酶切鑒定。
　　 2 SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離、純化和擴(kuò)增
　　 利用貼壁培養(yǎng)的方法從SD大鼠脛骨和股骨骨髓中分離純化BMSCs。BMSCs培養(yǎng)于含有15％小牛血清濃度的L-DMEM完全培養(yǎng)基中,3d首次換液,以后3-4d換液一次

10、,待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底時(shí)傳代。取第三代BMSCs做后續(xù)試驗(yàn)。
　　 3 pVP22-GATA-4/myc-His真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs
　　 轉(zhuǎn)染之前通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的細(xì)胞接種密度,轉(zhuǎn)染最佳體系。本實(shí)驗(yàn)采用陽離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000將質(zhì)粒GATA-4:VP22轉(zhuǎn)染BMSCs,于轉(zhuǎn)染后48h以免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印跡法檢測(cè)GATA-4:VP22融合蛋白在BMSCs中的表達(dá)。
　　 45-氮胞

11、苷誘導(dǎo)外源表達(dá)GATA-4的BMSCs向心肌分化
　　 本實(shí)驗(yàn)分為轉(zhuǎn)染組、未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組,轉(zhuǎn)染組為5-aza誘導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GATA-4基因的BMSCs:未轉(zhuǎn)染組為5-aza誘導(dǎo)的單純培養(yǎng)的BMSCs;空質(zhì)粒組為瞬時(shí)轉(zhuǎn)染PcDNA3.1空質(zhì)粒的BMSCs。用10μmol/濃度的5-aza分別對(duì)轉(zhuǎn)染組和未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞誘導(dǎo)24h。在誘導(dǎo)后的21、28d收集細(xì)胞,以免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印跡法檢測(cè)GATA-4:VP22融合蛋白、GATA

12、-4蛋白、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)在BMSCs中的表達(dá)。
　　 5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì),所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用配對(duì)t檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)分析方法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05,當(dāng)P＜0.05時(shí)認(rèn)為有顯著差異。
　　 結(jié)果:
　　 1成功篩選出pVP22-GATA-4/myc-His質(zhì)粒并進(jìn)行擴(kuò)增,酶切鑒定結(jié)果顯示:可獲得約7500bp(未經(jīng)酶切的質(zhì)粒)和1300bp(經(jīng)酶切后的目

13、的基因片段)兩條條帶,與質(zhì)粒構(gòu)建圖一致。
　　 2原代培養(yǎng)中,細(xì)胞是以克隆集落的方式增殖。接種后可見圓形、折光性較強(qiáng)的BMSCs散在分布,其間夾雜大量血細(xì)胞。24h后,少量BMSCs開始貼壁,剛貼壁的BMSCs仍保持圓形。72h后,大多數(shù)細(xì)胞已貼壁,貼壁細(xì)胞伸展呈多角形。未貼壁的細(xì)胞通過多次換液被清除。3-4d可見小的集落形成,7-14d,相鄰集落匯合成片達(dá)80％以上,細(xì)胞基本形態(tài)大致分為三種:紡錘樣成纖維形、小圓形和多角形。傳

14、代后,細(xì)胞于2-4h開始貼壁,24h內(nèi)完全貼壁,形態(tài)與原代細(xì)胞相似,3-5d匯合成片。第3代以后,細(xì)胞形態(tài)開始呈比較均一的成纖維狀,細(xì)胞排列呈明顯的漩渦狀、輻射狀。
　　 3實(shí)驗(yàn)確定,轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代密度:2×106/cm2;轉(zhuǎn)染的最佳體系:采用質(zhì)粒DNA(μ g)和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000(μ1)1:2.5的比率轉(zhuǎn)染。48h后用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印跡法檢測(cè)到轉(zhuǎn)染組GATA-4:VP22融合蛋白在BMSCs中有表達(dá)

15、,未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組無陽性表達(dá)。
　　 4細(xì)胞培養(yǎng)21、28d后,轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組用免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫印跡法均可分別檢測(cè)到GATA-4蛋白、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)在BMSCs中的表達(dá),且28d表達(dá)量比21d表達(dá)量高,兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)相比有顯著性差異(P＜0.05)。轉(zhuǎn)染組與未轉(zhuǎn)染組相比,在21、28d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn),轉(zhuǎn)染組GATA-4、cTnT兩個(gè)基因的表達(dá)量均比未轉(zhuǎn)染組高。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染組21d、28d時(shí)GATA-4和cTn

16、T的表達(dá)量均高于未轉(zhuǎn)染組,兩者相比有顯著差異(P＜0.01或P＜0.05)?？召|(zhì)粒組無陽性表達(dá)。
　　 5轉(zhuǎn)染組21d、28d的細(xì)胞經(jīng)免疫印跡法測(cè)定,仍可表達(dá)GATA-4:VP22,未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組無表達(dá)。
　　 結(jié)論:
　　 1在5-aza誘導(dǎo)條件下,外源轉(zhuǎn)染表達(dá)GATA-4基因的BMSCs向心肌分化的情況優(yōu)于未轉(zhuǎn)染的BMSCs細(xì)胞,說明轉(zhuǎn)錄因子GATA-4可以促進(jìn)BMSCs向心肌分化。
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