菊花硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CmNRT2s和轉(zhuǎn)錄因子CmLBD38的功能初步研究.pdf

1、菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.），是我國(guó)十大名花和世界四大切花之一。氮素作為植物生長(zhǎng)必需的大量元素，是構(gòu)成氨基酸、核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子的重要組成部分，在植物生長(zhǎng)和發(fā)育過程發(fā)揮著重大作用。為提高菊花產(chǎn)量和品質(zhì)，大量氮肥被施用于土地。然而，過量的氮肥使用及較低的氮肥利用率不僅嚴(yán)重降低了菊花的產(chǎn)量和品質(zhì)，而且導(dǎo)致了土壤次生鹽漬化和水體的富營(yíng)養(yǎng)化。為減少氮肥施用和提高植物氮肥利用率，深入研究菊花吸收利用

2、氮素的生理與分子機(jī)制意義重大。本試驗(yàn)依據(jù)實(shí)驗(yàn)室之前克隆得到的菊花CmNRT2s基因家族中的基因序列克隆得到了CmNRT2.5b和CmNRT2.7b基因及CmNRT2s啟動(dòng)子，并通過構(gòu)建表達(dá)裁體獲得轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草株系來(lái)綜合研究CmNRT2.5b和CmNRT2.7b的功能。同時(shí)也對(duì)轉(zhuǎn)錄因子CmLBD38進(jìn)行了克隆與功能分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.菊花CmNRT2s基因啟動(dòng)子克隆和功能元件分析
　　NRT2s基因家族在硝

3、酸鹽吸收轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著重要功能。通過染色體步移方法從菊花基因組中分離克隆獲得了CmNRT2.2、CmNRT2.3、CmNRT2.5、 CmNRT2.6和CmNRT2.7的啟動(dòng)子序列，長(zhǎng)度分別為1597bp、1231bp、949bp、2206bp和1567bp.通過Softberry數(shù)據(jù)庫(kù)和PLACE數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)多個(gè)與硝態(tài)氮響應(yīng)、碳代謝和光調(diào)控相關(guān)的功能元件，有助于進(jìn)一步了解CmNRT2s的表達(dá)特性和挖掘響應(yīng)硝態(tài)氮的順

4、式作用元件。
　　2.菊花CmNRT2.5b和CmNRT2.7b基因克隆及功能研究
　　利用RT-PCR技術(shù)克隆了切花菊‘南農(nóng)雪峰’高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CmNRT2.5和CmNR T2.7的cDNA片段，命名為CmNRT2.5b和CmNRT2.7b.將克隆得到的氨基酸序列與實(shí)驗(yàn)室之前得到的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，二者相似性為98.41％和99.34％.構(gòu)建表達(dá)裁體pMDC43-CmNRT2.5b和pMDC43-CmNRT2.7b轉(zhuǎn)

5、化擬南芥后各得到轉(zhuǎn)基因株系3個(gè)和5個(gè)。同時(shí)將克隆得到的菊花CmNRT2.5b和CmNRT2.7b啟動(dòng)子構(gòu)建到含GUS蛋白基因的pORER2載體上，瞬時(shí)轉(zhuǎn)化煙草后將葉片組培篩選培養(yǎng)后獲得煙草穩(wěn)定遺傳植株。這些轉(zhuǎn)基因材料的獲得為深入探討研究基因及啟動(dòng)子的功能奠定了基礎(chǔ)。
　　3.菊花CmLBD38基因克隆和功能分析
　　本研究通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)的EST序列信息、RT-PCR和RACE方法克隆出切花菊品種‘南農(nóng)雪峰’LBD家族基因的

6、cDNA全長(zhǎng)序列，命名為CmLBD38.序列分析表明:CmLBD38全長(zhǎng)845bp，其中開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)為525bp，編碼175個(gè)氨基酸;存在一個(gè)由107個(gè)氨基酸組成的LOB家族結(jié)構(gòu)域，屬于LBD基因家族;系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，CmLBD38與擬南芥LBDⅡ類轉(zhuǎn)錄因子親緣關(guān)系較近。構(gòu)建綠色熒光蛋白（GFP）融合表達(dá)載體pMDC43-CmLBD38、酵母表達(dá)載體pGBKT7-CmLBD38和35S∷GAL4-DB-CmLBD38以對(duì)C