五谷蟲二次免疫后的抗菌物質(zhì)對金葡菌和大腸桿菌結(jié)構(gòu)影響的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 分離獲得二次免疫后的五谷蟲抗菌物質(zhì)，并明確該抗菌物質(zhì)的抗菌機制。
　　 方法:
　　 1.無菌五谷蟲的培育
　　 (1)準(zhǔn)備和處理蟲卵:把在野外捕獲到的絲光綠蠅在無菌的實驗室條件下進(jìn)行飼養(yǎng)，等其產(chǎn)卵后再消毒。
　　 (2)五谷蟲的飼養(yǎng):在保持無菌的環(huán)境下，要求每日至少光照時間在12小時以上，空氣的濕度為60％，室內(nèi)溫度控制在25～27℃。
　　 (3)五谷蟲的消毒:首先放入3

2、.5％甲醛生理鹽水中浸泡5min，然后放入2％雙氧水中浸泡3min，最后用5％稀鹽酸溶液浸泡5min。在每一步處理完之后，都用無菌的重蒸水洗滌3次以上。并且保持經(jīng)消毒處理之后的五谷蟲依然有旺盛的生命活力。
　　 2.細(xì)菌的準(zhǔn)備
　　 (1)細(xì)菌活化:取4℃冷藏保存的大腸桿菌和金葡菌固體斜面，無菌接種環(huán)刮取少許菌落接種于20ml液態(tài)Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基中，37℃，120r/min培養(yǎng)17h，至菌液混濁，

3、將活化后的大腸桿菌和金葡菌置于4℃冰箱中冷藏保存?zhèn)溆谩?br>　　 (2)細(xì)菌的擴(kuò)大培養(yǎng):分別取100μl活化后的大腸桿菌和金葡菌菌液加入到10ml液態(tài)LB培養(yǎng)基中，37℃，120r/min繼續(xù)培養(yǎng)4h，再用無菌液態(tài)LB培養(yǎng)基稀釋大腸桿菌和金葡菌菌液的濃度為108cfu/ml，光密度值(OD)為0.5。
　　 3.五谷蟲與大腸桿菌和金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)（二次免疫）
　　 分八組每組四條五谷蟲，分別與之相對應(yīng)的菌濃(10

4、8-101cfu/ml)共培養(yǎng)6，12，18，24，30，36，42，48小時，選取在最長時間和最大菌濃條件下，生命力最旺盛的一組，然后按此條件大批量共培養(yǎng)。
　　 4.五谷蟲粗提物制備
　　 取共培養(yǎng)3齡五谷蟲幼蟲共計100條，加入2倍體積的TNE緩沖液(5mMEDTA，10mMTris-HCl，150mMNaCl，pH7.5)，并對其進(jìn)行充分的勻漿，勻漿液第一次離心(12000r/min，10min，4℃)，取上清液

5、。上清液加3倍體積的TNE緩沖液，沸水水浴2min，再次離心(12000r/min，4℃，10min)，取上清液，即為粗提物。
　　 5.Brandford法測定其蛋白含量
　　 6.多孔板MTT法檢測五谷蟲提取物對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌增殖的影響:
　　 首先用無菌ddH2O溶解已經(jīng)篩選出的具有明顯的抗菌活性的提取物。將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌用LB培養(yǎng)基培養(yǎng)至其對數(shù)生長期，然后用LB培養(yǎng)基稀釋菌濃至106c

6、fu/ml，最后在滅菌的96孔板的每個孔中加入菌液90μl。藥物組孔分別加進(jìn)倍比稀釋具有明顯的抗菌活性的提取物溶液10μl，陰性對照組孔則加入無菌的ddH2O10μl，陽性對照組孔加入10mg/ml的氨芐青霉素10μl，另外設(shè)一空白的調(diào)零孔，加入90μlTSB培養(yǎng)基和10μl無菌ddH2O，每組分別設(shè)4個重復(fù)孔。
　　 將96孔板置于培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)24h，每孔加入5mg/mlMTT溶液10μl，繼續(xù)共培養(yǎng)4h，最后將顯色的菌液離

7、心，去上清，加入10％DMSO100μl，終止反應(yīng)。用全自動酶標(biāo)測試儀測定600nm的吸光值(OD600)，計算抑制率(％)。
　　 7.對質(zhì)粒復(fù)制的影響
　　 在Eppendorf管中各加入5μL質(zhì)粒和15μL無菌水，然后依次加入各個不同濃度的五谷蟲提取液，以不含五谷蟲提取液的反應(yīng)體系作為對照，混勻后，37℃，恒溫箱下培養(yǎng)2小時，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，研究五谷蟲提取物對質(zhì)粒DNA的作用特點。
　　 8.對

8、大腸桿菌和金葡菌DNA復(fù)制的影響。
　　 采用PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，模板為指示菌基因組DNA，反應(yīng)體系中分別加入各種不同濃度的中藥五谷蟲提取液，以不含五谷蟲提取液的反應(yīng)體系作為對照，進(jìn)行進(jìn)行PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。取反應(yīng)后的各組的產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳分析，研究五谷蟲提取物對細(xì)菌TaqDNA聚合酶活性的影響。
　　 9.觀察五谷蟲提取物抗菌物質(zhì)對大腸桿菌和金葡菌超微結(jié)構(gòu)的影響:
　　 收集與MIC濃度五谷蟲提取物共培

9、養(yǎng)12h的大腸桿菌和金葡菌，取對數(shù)生長期的大腸桿菌和金葡菌作為對照，3000r/min離心10min，收集菌體，無菌生理鹽水洗滌后重懸于2.5％戊二醛中固定，常規(guī)鋨酸固定、濃度梯度乙醇脫水，掃描電鏡觀察細(xì)菌超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1.MTT法顯示五谷蟲提取物能夠明顯的抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的增殖，且對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.5mg/ml。
　　 2.瓊脂糖凝膠電泳

10、圖示當(dāng)提取物濃度在10mg/ml時，質(zhì)粒條帶未跑出;提取物濃度在1mg/ml時，質(zhì)粒條帶明顯變暗。
　　 3.瓊脂糖凝膠電泳圖示當(dāng)加入的提取物濃度在0.5mg/ml以上時，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌DNA經(jīng)PCR擴(kuò)增后所得產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳未得到電泳條帶。
　　 4.掃描電子顯微鏡示當(dāng)與0.5mg/ml的五谷蟲提取物抗菌物質(zhì)共培養(yǎng)12h后，金黃色葡萄球菌和大腸桿菌表面出現(xiàn)凹陷或孔洞甚至破裂。
　　 結(jié)論: