基于“主客交”理論的加減三甲散對肝纖維化大鼠肝臟蛋白質(zhì)組影響的實驗研究.pdf

1、目的：
　　觀察加減三甲散治療肝纖維化的療效，并從蛋白質(zhì)組層面揭示其作用機制，探索“主客交”理論的現(xiàn)代生物學基礎(chǔ)。
　　方法：
　　SPF級Wistar雄性大鼠24只，隨機分成正常組、模型組、陽性對照組（復(fù)方鱉甲軟肝片）、加減三甲散組。常規(guī)飼養(yǎng)7d后給模型組、陽性對照組、加減三甲散組采用豬血清腹腔注射復(fù)制免疫性肝纖維化模型。造模后各組均灌胃給藥，1次/d，三甲散組劑量為8.125g·kg-1，鱉甲片組劑量為0.625g

2、·kg-1,模型組及正常組予0.9％生理鹽水等體積灌胃。治療60d后麻醉處死大鼠取肝臟，HE和MASSON染色觀察病理形態(tài)，免疫組化CD34標記檢測肝臟微血管密度（MVD），ELLISA法檢測血清肝功能相關(guān)指標、肝纖維化指標，全自動血液流變學檢測儀檢測血液流變學指標，利用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)對四組大鼠肝臟進行比較蛋白組學研究，Western blotting法驗證部分差異蛋白的表達水平。
　　結(jié)果：
　　1.光

3、鏡下正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞未見變性及壞死，無明顯纖維結(jié)締組織增生。模型組大鼠肝細胞腫脹，出現(xiàn)脂肪或氣球樣變，大量纖維組織出現(xiàn)在中央靜脈至匯管區(qū)，有假小葉形成。加減三甲散組及陽性對照組大鼠肝細胞輕度腫脹，排列紊亂，少量纖維組織增生。與正常組比較，模型組、陽性對照組、加減三甲散組大鼠肝組織炎癥活動度分級和纖維化程度分期及膠原纖維面積百分比均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、加減三甲散組肝組織炎癥活動度分級和纖維化

4、程度分期及膠原纖維面積百分比均明顯降低（P＜0.05）；陽性對照組與加減三甲散組之間上述指標比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　2.與正常組比較，模型組、陽性對照組、加減三甲散組大鼠MVD水平顯著增高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組、加減三甲散組MVD水平顯著下降（P＜0.05）；陽性對照組與加減三甲散組之間MVD水平比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　3.與正常組比較，模型組大鼠血清AST、ALT、GLB水平

5、均明顯升高（P＜0.05）；與模型組大鼠比較，加減三甲散組及陽性對照組大鼠血清AST水平顯著下降，陽性對照組大鼠血清GLB水平顯著下降（P＜0.05）；陽性對照組與加減三甲散組之間大鼠血清AST、ALT、GLB、ALB及A/G水平比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　4.與正常組比較，模型組大鼠血清HA、LN、PCⅢ、CⅣ水平均明顯升高（P＜0.05），加減三甲散組及陽性對照組大鼠血清PCⅢ、HA水平顯著升高（P＜0.05）；與模

6、型組比較，加減三甲散組及陽性對照組大鼠血清HA、LN、PCⅢ水平明顯下降（P＜0.05）。
　　5.與正常組比較，模型組大鼠全血高切粘度(200S-1)、全血低切粘度(5S-1)、紅細胞壓積、血沉均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，三甲散組及陽性對照組大鼠全血高切粘度(200S-1)、全血低切粘度(5S-1)、紅細胞壓積、血沉水平明顯下降（P＜0.05）。陽性對照組與加減三甲散組之間大鼠全血高切粘度(200S-1)、低切粘度

7、(5S-1)、紅細胞壓積、血沉水平比較無明顯差異（P＞0.05）。
　　6.本次研究共篩選出108個差異表達蛋白。在模型組與正常組比較中，共有72個差異表達蛋白，其中29個蛋白表達上調(diào)，43個蛋白表達下調(diào)；在加減三甲散組與模型組比較中，共有43個差異表達蛋白，其中19個蛋白表達上調(diào)，24個蛋白表達下調(diào)；同時在模型組與正常組比較、加減三甲散組與模型組比較中均有差異的蛋白有7個。主要包括涉及機體代謝的酶蛋白，其次是機體免疫系統(tǒng)相關(guān)蛋白

8、，參與細胞發(fā)育調(diào)控的蛋白及一些生物調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白等。
　　7.模型組與空白組比較，Cofilin2和NADH dehydrogenase在模型組表達下調(diào)，ACSM3在模型組表達上調(diào)；加減三甲散組與模型組比較，Cofilin2和NADH dehydrogenase在加減三甲散組表達上調(diào)，ACSM3在加減三甲散組表達下調(diào)。Western blotting驗證結(jié)果與蛋白組學研究結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　1.采用豬血清腹腔注射

9、法可成功復(fù)制大鼠免疫性肝纖維化模型。
　　2.加減三甲散可改善肝纖維化模型大鼠病理形態(tài)、部分血清肝纖維指標及肝功能指標及血液流變性指標。
　　3.采用iTRAQ聯(lián)合LC-MS/MS技術(shù)共鑒定并篩選出108個差異表達蛋白，這些差異表達蛋白可能通過交互作用共同體現(xiàn)“主客交”理論部分內(nèi)涵。
　　4.Cofilin2、ACSM3及NADH dehydrogenase可能是加減三甲散治療肝纖維化的關(guān)鍵作用靶點，值得進一步深入研究