蒙醫(yī)“三根調(diào)節(jié)法”對(duì)脂肪細(xì)胞和NAFLD大鼠模型肝臟組織糖脂代謝的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景和目的:
　　 非酒精性脂肪肝(NAFLD)發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，成為全球引起慢性肝病和肝功能異常的首要原因之一，在總體人群中患病率已高達(dá)15-30％。NAFLD 被認(rèn)為是代謝綜合征的肝臟表現(xiàn)，主要病理生理機(jī)制為胰島素抵抗(IR)和氧化應(yīng)激，病理表現(xiàn)為脂肪在肝臟積累。IR是以胰島素抑制肝臟釋放葡萄糖、促進(jìn)周圍組織攝取和利用葡萄糖的能力下降為特征的病理生理過程。在NAFLD 狀態(tài)下，肝臟的糖脂代謝紊亂導(dǎo)致肝臟葡萄糖和VLDL的

2、輸出增加，血漿甘油三酯濃度升高，高密度脂蛋白膽固醇(HDL)水平降低。而脂肪組織的糖脂代謝紊亂則引起脂肪組織葡萄糖攝取減少和脂肪分解增加，產(chǎn)生過量的游離脂肪酸以及甘油進(jìn)入血液循環(huán)。
　　 蒙醫(yī)“三根調(diào)節(jié)法”即依據(jù)蒙醫(yī)對(duì)非酒精性脂肪肝(NAFLD)的病因病理機(jī)制的認(rèn)識(shí)，以及“赫依”、“希拉”、“巴達(dá)干”等辯證論治理論，選出的對(duì)NAFLD 療效頗佳的利肝石榴八味散、地格達(dá)-4和通拉嘎-5 三味方劑。利肝石榴八味散是祛“巴達(dá)干”的代表

3、方劑；地格達(dá)-4是清“希拉”的代表方劑；通拉嘎-5是治療“赫依”的代表方劑。利肝石榴八味散的主要成分為石榴、肉桂、豆蔻、蓽茇、紅花、草果、干姜、光明鹽；地格達(dá)-4的主要成分為肋柱花、黃連、梔子、瞿麥；通拉嘎-5的主要成分為石榴、肉桂、豆蔻、蓽茇、紅花。蒙醫(yī)辯證治療糖尿病的臨床療效證明通拉嘎-5、利肝石榴八味散、地格達(dá)等藥物成分有輔助降糖作用，還可以改善血液粘度，治療早期糖尿病腎病，但其具體的作用機(jī)制不明。有文獻(xiàn)報(bào)道以地格達(dá)-4為主藥治療

4、NAFLD，可以使患者肝功能、B 超等指標(biāo)恢復(fù)正常。臨床上有關(guān)于通拉嘎-5與辛伐他汀降脂效果的對(duì)比性研究，結(jié)果顯示通拉嘎-5 有明顯的降低總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇的作用，但至今沒有關(guān)于利肝石榴八味散對(duì)脂代謝影響的相關(guān)研究報(bào)道。但蒙醫(yī)“三根調(diào)節(jié)法”
　　 治療NAFLD的具體機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步的研究。
　　 本研究以3T3-L1脂肪細(xì)胞和NAFLD大鼠模型肝臟組織為研究對(duì)象，分別檢測(cè)利肝石榴八味散、地格

5、達(dá)-4、通拉嘎-5對(duì)它們的葡萄糖攝取和脂肪酸氧化的影響，并檢測(cè)在糖脂代謝中發(fā)揮重要作用的PPARs、LXR α、I κ B α、iNOS、Akt、P-Akt的表達(dá)變化，以期明確蒙醫(yī)“三根調(diào)節(jié)法”治療NAFLD的機(jī)制。
　　 方法：
　　 1、3T3-L1前脂肪細(xì)胞按照ATCC 推薦的方法培養(yǎng)，加入IBMX(終濃度0.5mM)、地塞米松(終濃度1μM)、胰島素(終濃度10mg/L)誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞。分化成熟的脂肪細(xì)胞用油

6、紅O 染色的方法進(jìn)行鑒定。
　　 2、將分化成熟的脂肪細(xì)胞接種于96孔板，用蒙藥誘導(dǎo)細(xì)胞12小時(shí)、24小時(shí)、48小時(shí)、72小時(shí)，濃度分別為136.36mg/L、27.27mg/L、6.81mg/L、1.36mg/L、0.27mg/L，空白組和PBS組作為對(duì)照，吞噬MTT后檢測(cè)OD值，每組至少重復(fù)3孔。
　　 3、選用終濃度6.81mg/L、27.27mg/L的蒙藥處理細(xì)胞，PBS作為陰性對(duì)照共培養(yǎng)24h，[ 3 H]2-

7、DG 示蹤檢測(cè)脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，14 C-palmitic 示蹤檢測(cè)脂肪細(xì)胞的脂肪酸氧化情況。
　　 4、選用終濃度6.81mg/L、27.27mg/L的蒙藥處理細(xì)胞48h，空白組和PBS組作為對(duì)照，Real-time PCR 檢測(cè)其PPARs和LXR α基因表達(dá)情況，western blot 檢測(cè)其PPARs、LXR α、I κ B α、iNOS、Akt、P-Akt蛋白表達(dá)情況。
　　 5、Real-time PC

8、R 檢測(cè)NAFLD大鼠模型肝臟組織PPARs和LXR α基因表達(dá)情況，western blot 檢測(cè)其PPARs、LXR α、I κ B α、iNOS、Akt、P-Akt蛋白表達(dá)情況。
　　 結(jié)論：κ B α蛋白表達(dá)明顯增加，LXR α和iNOS的蛋白表達(dá)顯著下降。通拉嘎-5 治療后，NAFLD大鼠肝臟組織PPAR α、γ、Akt、P-Akt、I κ B α蛋白表達(dá)明顯增加，LXR α和iNOS蛋白表達(dá)顯著下降，PPAR β蛋白

9、表達(dá)變化沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1、3T3-L1前脂肪細(xì)胞被成功誘導(dǎo)分化為3T3-L1脂肪細(xì)胞，MTT 實(shí)驗(yàn)顯示三種方劑對(duì)脂肪細(xì)胞的最佳作用時(shí)間均為48h，最佳作用濃度均為6.81mg/L。
　　 2、利肝石榴八味散可促進(jìn)脂肪細(xì)胞的葡萄糖攝取，其機(jī)制可能與增加PPARs、I κ B α、Akt、P-Akt和抑制iNOS、LXR α表達(dá)有關(guān)。通拉嘎-5 也有促進(jìn)脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取的作用，其可能是通過上調(diào)PPAR α、PPA

10、R β、LXR α、I κ B α、Akt、P-Akt和下調(diào)iNOS表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。不同的是，地格達(dá)-4 主要是促進(jìn)脂肪細(xì)胞的脂肪酸氧化，其作用機(jī)制為增加PPAR α、PPAR β、I κ B α、Akt、P-Akt 而下調(diào)LXR α和iNOS蛋白表達(dá)。
　　 3、高脂飲食可以通過降低PPAR α、PPAR γ、I κ B α、Akt、P-Akt表達(dá)，增加LXR α、iNOS表達(dá)，來增加大鼠肝臟的脂肪積累，產(chǎn)生IR和氧化應(yīng)激等，進(jìn)一