原發(fā)性膽汁性肝硬化模型鼠發(fā)病過(guò)程中造血系統(tǒng)、細(xì)胞因子、腸道菌群的作用研究.pdf

1、原發(fā)性膽汁性肝硬化（簡(jiǎn)稱(chēng)PBC）是一種由于免疫系統(tǒng)攻擊肝內(nèi)小膽管而引起的慢性膽汁淤積性自身免疫疾病。PBC以對(duì)線(xiàn)粒體自身抗原的耐受丟失和小膽管的破壞為特征。晚期病人會(huì)出現(xiàn)肝纖維化與肝硬化的發(fā)展，嚴(yán)重威脅患者的生命健康。在以往的研究中，我們建立了IL-2Rα(-/-)小鼠作為人類(lèi)PBC的動(dòng)物模型。IL-2Rα(-/-)小鼠的血清中出現(xiàn)抗線(xiàn)粒體抗體(AMA)，組織病理學(xué)上存在著明顯的門(mén)脈炎癥和膽管破壞，肝臟中存在著CD4+T細(xì)胞與CD8+T

2、細(xì)胞浸潤(rùn)，多種炎性細(xì)胞因子的水平升高。這些結(jié)果表明IL-2Rα(-/-)小鼠能夠自發(fā)自身免疫性膽管炎，并具有多種類(lèi)似于人類(lèi)PBC的癥狀。而且這種小鼠同時(shí)自發(fā)產(chǎn)生炎癥性腸?。ê?jiǎn)稱(chēng)IBD），因此IL-2Rα(-/-)小鼠也可以用于研究腸道微環(huán)境（包括腸道菌群和腸道炎癥）與肝臟炎癥的相互作用。前期的研究工作顯示，在IL-2Rα(-/-)小鼠中敲除CD4會(huì)減輕結(jié)腸炎癥但不影響肝臟炎癥，而敲除CD8會(huì)減弱膽管破壞和門(mén)脈炎癥但不影響結(jié)腸炎癥。在IL

3、-2Rα(-/-)小鼠中可以發(fā)現(xiàn)存在著比野生型對(duì)照小鼠增強(qiáng)的Th1和Th17型反應(yīng)。我們的前期工作證明IL-2Rα(-/-)小鼠的血清IL-12p40水平比IL-2Rα(+/-)小鼠要高。IL-12p40是IL-12與IL-23的共同亞基，IL-12與IL-23均屬于IL-12家族，IL-12家族在多種自身免疫病中有著較為重要的作用。尤其是在基于人類(lèi)PBC的全基因組關(guān)聯(lián)分析研究中，IL-12相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)與PBC相關(guān)。但是IL-12p4

4、0在PBC中的具體作用尚不清楚。
　　因此我們嘗試在IL-2Rα（-/-）小鼠中敲除IL-12p40以研究IL-12p40在PBC中的作用，結(jié)果顯示相比IL-2Rα(-/-)小鼠，IL-12p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠可以作為一個(gè)更好的PBC模型。我們?cè)谶@個(gè)模型之上對(duì)于造血干細(xì)胞、細(xì)胞因子、腸道菌群進(jìn)行了深入的研究。得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.IL-12p40的敲除加重了IL-2Rα(-/-)小鼠的自身免疫性

5、膽管炎癥并引起肝纖維化
　　令人驚奇的是p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠顯示出更加嚴(yán)重的門(mén)脈炎癥與膽管損傷，但是其腸炎顯著減輕。p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠高比例出現(xiàn)脾腫大的癥狀，其脾臟與肝臟細(xì)胞數(shù)均顯著高于IL-2Rα(-/-)小鼠，但腸系膜淋巴結(jié)的細(xì)胞數(shù)要明顯低于IL-2Rα(-/-)小鼠。有趣的p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠的脾臟細(xì)胞數(shù)與肝臟細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，但腸系膜淋巴結(jié)的細(xì)胞數(shù)與肝臟細(xì)胞

6、數(shù)沒(méi)有關(guān)聯(lián)。我們通過(guò)纖維化評(píng)分、羥脯氨酸含量測(cè)定、免疫組化、實(shí)時(shí)定量熒光PCR等多種方法證明，與IL-2Rα(-/-)小鼠最突出的區(qū)別是p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠能夠自發(fā)肝纖維化，以此可以模擬PBC患者病程中晚期癥狀。
　　我們分析了p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的表型，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比例增高。p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的肝臟CD8+T細(xì)胞主要是效應(yīng)性記憶性

7、細(xì)胞，而IL-2Rα(-/-)小鼠的肝臟CD8+T細(xì)胞主要是中樞性記憶性細(xì)胞。p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠的肝臟CD4+T與CD8+T細(xì)胞主要是PD-1+的細(xì)胞，而IL-2Rα(-/-)小鼠的肝臟CD4+T與CD8+T細(xì)胞主要是PD-1-的細(xì)胞。與IL-2Rα(-/-)小鼠相比，p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠的CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ和IL-10的能力上升，而分泌IL-17A的能力下降。RT-PCR的結(jié)果也

8、證明p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠肝臟中Th1型反應(yīng)增強(qiáng)，Th17反應(yīng)受到抑制。
　　2.p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的造血系統(tǒng)異常
　　有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠與野生型小鼠相比，骨髓Lineage-c-Kit+Sca-1+細(xì)胞（LSK細(xì)胞）的數(shù)目和比例都有所增加。p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠存在著髓外造血現(xiàn)象，表現(xiàn)在脾臟與肝臟中出現(xiàn)LSK細(xì)胞。LS

9、K細(xì)胞通常被認(rèn)為包含有造血干細(xì)胞(HSC)和前體細(xì)胞。p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠中的骨髓LSK細(xì)胞表型與野生型小鼠相差很大，它們具有更大的細(xì)胞體積和顆粒度（高FSC和SSC），更低的CD86表達(dá)，并且CD150/CD48與CD34/CD135的表達(dá)方式不同。p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠骨髓中紅細(xì)胞、B細(xì)胞和NK細(xì)胞的比例與數(shù)目均降低，提示我們?cè)撔∈蟮脑煅杉?xì)胞的造血功能存在障礙。令人驚奇的是，p40（-/-

10、）IL-2Rα（-/-）小鼠的骨髓LSK細(xì)胞高表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子，暗示這群細(xì)胞可能作為抗原提呈細(xì)胞(APC)行使功能，而野生型小鼠則不會(huì)出現(xiàn)類(lèi)似特征。
　　我們發(fā)現(xiàn)p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓T細(xì)胞包括CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比例與數(shù)目均顯著升高。我們猜測(cè)骨髓T細(xì)胞對(duì)于LSK細(xì)胞的異常起著重要的作用。我們檢測(cè)年齡較小的小鼠的狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)3周與4周時(shí)的p40(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠出現(xiàn)了明顯的脾

11、臟腫大、骨髓T細(xì)胞浸潤(rùn)和骨髓LSK細(xì)胞異常，而2周的p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠卻沒(méi)有這些現(xiàn)象。因此我們假設(shè)小鼠在離乳后腸道細(xì)菌的改變可能通過(guò)T細(xì)胞來(lái)影響骨髓LSK細(xì)胞的異常。
　　我們使用骨髓嵌合的方法，對(duì)p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓造血能力是否改變進(jìn)行了探究，將Ly5.2 p40(-/-)IL-2Rα（+/-）小鼠與Ly5.1 p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓細(xì)胞在用紅細(xì)胞裂解

12、液處理后以1∶1的比例進(jìn)行嵌合，轉(zhuǎn)輸給致死劑量輻照過(guò)的Ly5.1/5.2小鼠中。8周后殺鼠檢測(cè)各臟器中來(lái)自L(fǎng)y5.1小鼠與Ly5.2小鼠的細(xì)胞的比例。結(jié)果證明p40(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠全骨髓的重建能力要低于p40(-/-)IL-2Rα(+/-)小鼠。我們同樣進(jìn)行了骨髓LSK細(xì)胞1∶1嵌合的實(shí)驗(yàn)，結(jié)果p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠LSK的重建能力要遠(yuǎn)低于p40（-/-）IL-2Rα(+/-)小鼠，說(shuō)明p40（-

13、/-）IL-2Rα（-/-）小鼠的骨髓LSK細(xì)胞很多都是造血功能較弱的前體細(xì)胞。
　　3.IFN-γ是p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠造血系統(tǒng)異常的關(guān)鍵細(xì)胞因子
　　由于p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠的骨髓存在著增強(qiáng)的T細(xì)胞浸潤(rùn)并且p40(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠的T細(xì)胞高表達(dá)IFN-γ，我們猜想T細(xì)胞來(lái)源的IFN-γ對(duì)于LSK細(xì)胞失調(diào)起著至關(guān)重要的作用。我們將p40（-/-）IL-2Rα（-

14、/-）小鼠與IFN-γ（-/-）小鼠雜交得到p40（-/-）IFN-γ(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠，并與p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠進(jìn)行對(duì)比。我們發(fā)現(xiàn)p40（-/-）IFN-γ（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠依然存在著肝臟炎癥，但是不再出現(xiàn)“巨脾”的現(xiàn)象。p40(-/-)IFN-γ(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠的T細(xì)胞在肝臟與脾臟中的比例并沒(méi)有改變，其表型依然處于高度活化狀態(tài)。然而我們發(fā)現(xiàn)在p40（-/-

15、）IFN-γ（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠骨髓中浸潤(rùn)的T細(xì)胞的比例和數(shù)目下降，同時(shí)該小鼠骨髓中B細(xì)胞與紅細(xì)胞的比例和數(shù)目上升。重要的是，p40（-/-）IFN-γ(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠的骨髓LSK細(xì)胞的比例、數(shù)目與表型完全恢復(fù)正常，并且?guī)缀醪槐磉_(dá)MHCⅡ類(lèi)分子。這證明p40(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠的造血系統(tǒng)異常完全依賴(lài)于IFN-γ。
　　4.腸道微生物參與調(diào)節(jié)p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小

16、鼠的肝臟炎癥與造血系統(tǒng)
　　為了清除腸道中絕大多數(shù)的共生菌，我們用含有氨芐青霉素，甲硝唑，新霉素以及萬(wàn)古霉素這四種抗生素的水從4周齡起飼養(yǎng)SPF級(jí)的p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠。在抗生素喂養(yǎng)8周后，即小鼠12周時(shí)殺鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)清除腸道微生物可以顯著減輕p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠的脾腫大和肝臟炎癥。清除了腸道菌的p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的各臟器T細(xì)胞的比例和數(shù)目下降，并且T細(xì)胞的效應(yīng)性

17、記憶細(xì)胞的比例下降，其分泌IFN-γ的能力也下降。清除了腸道菌的p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠的骨髓LSK細(xì)胞的比例和數(shù)目下降，一些LSK細(xì)胞異常的特征也得到一定程度的改善。這些數(shù)據(jù)證明了腸道共生菌在p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠中能夠促進(jìn)肝臟炎癥和骨髓造血系統(tǒng)異常。
　　我們提取了p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠與p40(-/-)IL-2Rα(+/-)小鼠的結(jié)腸中糞便的基因組DNA，通過(guò)qPCR

18、檢測(cè)16S RNA類(lèi)型來(lái)測(cè)定一些種類(lèi)細(xì)菌的含量。我們將p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠根據(jù)脾臟重量分成巨脾和非巨脾的2組，并將它們的結(jié)果與p40(-/-)IL-2Rα（+/-）小鼠進(jìn)行對(duì)比。有意思的是，非巨脾的p40（-/-）IL-2Rα(-/-)小鼠的放線(xiàn)菌門(mén)、β-變形菌綱、γ-變形菌綱與乳酸桿菌群的含量比起巨脾的p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠和p40（-/-）IL-2Rα(+/-)小鼠有所增高，而我們并沒(méi)有觀察

19、到巨脾的p40(-/-)IL-2Rα（-/-）小鼠和p40(-/-)IL-2Rα(+/-)小鼠之間存在著差異。非巨脾的p40（-/-）IL-2Rα（-/-）小鼠中失調(diào)的腸道菌群可能對(duì)于炎癥起到了抑制的作用。但是具體是那些細(xì)菌在p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠中起到何種作用尚不清楚。
　　綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)p40(-/-)IL-2Rα(-/-)小鼠的自身免疫性膽管炎加重同時(shí)結(jié)腸炎減輕，并且能夠自發(fā)肝纖維化，因此比起IL-