含銅不銹鋼冠脈支架材料對(duì)血管細(xì)胞增殖的影響.pdf

1、目的:
　　 冠心病是一種最常見的心血管疾病，是由于心臟冠狀動(dòng)脈管壁形成粥樣斑塊所造成的血管腔狹窄和供血不足的心臟病變。目前，治療血管狹窄與閉塞等疾病的方法多采用經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈腔內(nèi)血管成形術(shù)（Percutaneous transluminal coronaryangioplasty PTCA），即在冠狀動(dòng)脈內(nèi)球囊擴(kuò)張術(shù)的基礎(chǔ)上在狹窄的部位植入支架，球囊擴(kuò)張后，支架將病變部位血管擴(kuò)張，增加了血流量以達(dá)到治療目的。然而，大約20％-3

2、0％接受過(guò)血管內(nèi)支架置入術(shù)治療的病人會(huì)發(fā)生血管再狹窄的現(xiàn)象。其中，約有10％的病人需要再次植入支架，這給患者帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)以及心理上的負(fù)擔(dān)。為了減少二次血栓的形成，人們開展了新型心血管不銹鋼支架材料的基礎(chǔ)研究和醫(yī)用開發(fā)。銅是人體內(nèi)一種必需微量元素，參與了生命活動(dòng)的多個(gè)環(huán)節(jié)，具有重要的生物學(xué)作用。因此，人們?cè)噲D將銅作為一種元素?fù)饺朐谛难懿讳P鋼支架材料中，防止血管再狹窄。但是，含銅不銹鋼能否作為血管支架的材料，還需要在分子和細(xì)胞水平上進(jìn)

3、行全面和認(rèn)真的考證。本實(shí)驗(yàn)利用分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)研究了含銅不銹鋼冠脈支架材料對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響。該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和結(jié)論對(duì)為探究再狹窄機(jī)制，新型金屬支架材料的研發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)材料與方法:
　　 一、觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況
　　 將體外培養(yǎng)的大鼠平滑肌細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)3天和7天，然后取出長(zhǎng)有

4、細(xì)胞的金屬片，用姬姆薩染液進(jìn)行細(xì)胞染色，置于金相顯微鏡下觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞在兩種不銹鋼金屬材料表面上的細(xì)胞生長(zhǎng)狀況。
　　 二、細(xì)胞生長(zhǎng)活性的測(cè)定
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，放入37℃、5％CO2培養(yǎng)箱，各組均在開始培養(yǎng)后的1、3、5和7天取樣，通過(guò)MTT法測(cè)定細(xì)胞的生長(zhǎng)活性，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定OD值，求出每一組的平均OD值。
　　 三、細(xì)胞生長(zhǎng)

5、曲線的測(cè)定
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，將細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，接種于各組24孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，各組均在開始培養(yǎng)后的7天內(nèi)每天連續(xù)收集細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，并通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
　　 四、細(xì)胞周期分析
　　 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每組細(xì)胞均在開始培養(yǎng)7天后用不含血

6、清的新鮮培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24h，再更換為含有10％胎牛血清的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，在不同時(shí)間點(diǎn)分別取樣，并收集細(xì)胞置于離心管中，通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。
　　 五、細(xì)胞凋亡檢測(cè)
　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細(xì)胞置于離心管中通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)。
　　 六、實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

7、>　　 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的血管內(nèi)皮細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于各組6孔培養(yǎng)板中，在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。各組均在開始培養(yǎng)后的7天取樣，并收集細(xì)胞置于1.5 mL離心管中。然后提取RNA，測(cè)定各組RNA純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄得到DNA模板，按照Takara說(shuō)明書的要求進(jìn)行Real-Time PCR的檢測(cè)。以基因GAPDH作為內(nèi)參，定量分析316L和316L-Cu兩種不銹鋼金屬支架材料對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞基因水平表達(dá)的影響。
　　

8、結(jié)果:
　　 1、通過(guò)顯微鏡對(duì)大鼠平滑肌細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞數(shù)目的觀察、MTT實(shí)驗(yàn)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞增殖活性的檢測(cè)和流式細(xì)胞儀對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞周期的檢測(cè)可以看出，在316L-Cu不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞其細(xì)胞生長(zhǎng)水平低于在316L不銹鋼金屬材料上培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞。
　　 2、通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，可以看出培養(yǎng)在316L-Cu不銹鋼金屬材料上的血管內(nèi)皮細(xì)胞在培養(yǎng)7天后其細(xì)胞早期凋亡的比例比培養(yǎng)在316