AECM與誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)細(xì)胞構(gòu)建組織工程神經(jīng)移植物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、前言: 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是存在于骨髓中的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)體外培養(yǎng)的BMSCs可以在體內(nèi)、體外向神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化。BMSCs易于獲取并能在體外迅速擴(kuò)增獲得足夠數(shù)量的細(xì)胞，因此被認(rèn)為是理想的組織工程種子細(xì)胞。脫細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)材料(AECM)是以SC基底膜管為主、以神經(jīng)外膜為外套的完整的三維網(wǎng)狀支架；它作為有生物活性的神經(jīng)替代物，具有良好的仿生性，較低的免疫原性。本實(shí)驗(yàn)探尋骨髓間充質(zhì)

2、干細(xì)胞的的體外培養(yǎng)、純化、增殖的技術(shù)平臺(tái)，如何簡(jiǎn)便容易的獲得理想的組織工程種子細(xì)胞并初步驗(yàn)證其經(jīng)抗氧化誘導(dǎo)劑向神經(jīng)組織細(xì)胞分化機(jī)制；與AECM在體外條件共培養(yǎng)作為神經(jīng)組織工程支架材料進(jìn)行周圍神經(jīng)損傷的可行性。為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究和臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 材料與方法: 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠15只，體重為100-120克；Wistar大鼠25只，180-200克；雌雄不限。 2、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體

3、外培養(yǎng)、純化、鑒定、誘導(dǎo)以及與AECM在體外條件共培養(yǎng)收集用10％FBS低糖DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔的沖洗液，置入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，24小時(shí)后全量換液；待細(xì)胞匯合80％時(shí)，按1：2傳代培養(yǎng)。取三代細(xì)胞用CD 44、CD34抗體進(jìn)行鑒定。用含有1mmol/L β-ME、低糖DMEM誘導(dǎo)，誘導(dǎo)后的細(xì)胞微量進(jìn)樣器注入到脫細(xì)胞神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)材料(AECM)內(nèi)。 3、觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)觀察、誘導(dǎo)后免疫細(xì)胞化學(xué)染色、含有

4、細(xì)胞的AECM變色酸2R-亮綠染色、GFAP、NSE免疫組織化學(xué)染色。 結(jié)果: 1、三代的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞趨于均質(zhì)純化，傳至九代以后表現(xiàn)出明顯的自分化，其在3-7代最適合供做誘導(dǎo)、組子工程種子細(xì)胞；β-ME誘導(dǎo)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可向神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞方向分化。 2、AECM與誘導(dǎo)的細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)細(xì)胞在AECM內(nèi)發(fā)生分化，BMSCs與AECM具有良好的細(xì)胞親和性，兩者可以復(fù)合構(gòu)建組織工程人工神經(jīng)。 結(jié)論:

5、 1、采用骨髓沖洗液貼壁培養(yǎng)法即可獲得純度很高，形態(tài)典型，生物學(xué)形態(tài)穩(wěn)定的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，其在3-7代最適合供做誘導(dǎo)、組子工程種子細(xì)胞、以及藥物篩選、細(xì)胞毒性等實(shí)驗(yàn)。 2、β-ME做誘導(dǎo)劑可以使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)組織方向分化，誘導(dǎo)的細(xì)胞可以表現(xiàn)神經(jīng)元特異性抗原以及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞抗原。但離誘導(dǎo)成為有功能的、穩(wěn)定的神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞尚遠(yuǎn)，提示骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化是多步驟、多因素影響的結(jié)果。 3、AECM與誘導(dǎo)的細(xì)