外源性磷酸肌酸在大鼠的藥代動力學和代謝處置的研究.pdf

1、目的:(1)建立一種離子對反相高效液相色譜法(IP—RPHPLC)同時測定大鼠血漿和紅細胞(RBC)中磷酸肌酸(PCr)及其代謝產(chǎn)物肌酸(Cr)以及相關(guān)ATP的濃度,為外源性PCr藥代動力學和代謝處置研究提供生物分析方法學。(2)研究PCr靜注和口服后在大鼠的血漿藥代動力學特點以及口服生物利用度。(3)研究PCr靜注給藥后的代謝處置和代謝物動力學。(4)研究PCr靜注后大鼠RBC藥代動力學。
　　 方法:IP-RPHPLC色譜測

2、定條件:固定相為Kromasil-C18色譜柱(4.6×250mm,5μm),流動相由0.2％KH2P04＋0.08%四丁基硫酸氫銨混合溶液(PH3.0)(A)、0.2%KH2P04＋0.08%四丁基硫酸氫銨混合溶液以1 N NaOH調(diào)PH7.5(B),以及甲醇(C)組成。梯度洗脫:0～8min(100%A,1 mL/min)→8～10min(85%B＋15%C,1.2 mL/min)→10～18min(85%B＋15%C,1.2mL/

3、min)→18～20rain(80%B＋20%C,1.3 mL/min)→20～29min(80%B＋20%C,1.3 mL/min)→29～30min(100%A,1 mL/min)。測定波長為210 nm(PCr、Cr)、260 nm(ATP、TMP)。血漿以及RBC樣品的預處理采用6%高氯酸沉淀蛋白,離心后的上清液立即以K2CO3中和至中性。以上操作均在冰浴低溫下進行,以防PCr降解。選用甲氧芐啶(TMP)為內(nèi)標,以峰面積比內(nèi)標法

4、定量,以基線扣除法計算外源性PCr、Cr和相關(guān)ATP。藥代動力學研究中,大鼠靜注和口服給藥后不長時間采血分離血漿和RBC,經(jīng)預處理凈化后采用IP-RPHPLC法分析。測定上述PCr、Cr和ATP濃度。計算有關(guān)藥代動力學參數(shù),以及生物利用度等。
　　 結(jié)果:在上述色譜條件下,血漿及RBC中PCr、Cr、ATP及TMP均達基線分離,且不受空白基質(zhì)的干擾,血漿及RBC中PCr、Cr、ATP及TMP的t值分別為5.8、3.4、27.2和

5、17.8min,PCr在10～7500μg/mL(血漿)、10～2500μg/mL(RBC),Cr和ATP在10～1500μg/mL(血漿)、10～750μg/mL(RBC)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2＞0.99);三種分析物QC樣品的日內(nèi)和日間精密度(RSD)分別為≤8.98%和≤8.42%(血漿)以及≤8.02%和≤6.41%(RBC)。準確度在97.86～104.68%(血漿)和97.73～105.04%(RBC);在血漿和RBC的回

6、收率均＞90%。方法學驗證表明該法特異性強,精密度和準確度高,均符合國家藥監(jiān)局要求。靜注PCr1000 mg/kg和500 mg/kg后,血漿中的Per消除符合二室模型一級動力學,消除半衰期t1/2β為22.5～23.3 min;表觀分布容積Vd為0.9564～00.9786 L/kg;清除率CL為0.029 L/(kg·min);靜注PCr后血漿中迅即測出其降解產(chǎn)物Cr,消除類似血管外給藥一室模型、一級動力學,其達峰時間tmax為20

7、min:消除半衰期t1,2k(m)為40.6～42.7min;較原藥PCr的消除半衰期長:由分別靜注原藥和合成代謝物后所得Cr的AUC計算得Cr的生成分數(shù)f(m)為60～76%。大鼠灌胃PCr后血漿中未測出PCr,但測出Cr,Cr的t1/2k(m)為56.0～57.7min;達峰值時間tmax為90～95min。根據(jù)靜注PCr和灌胃PCr后代謝產(chǎn)物Cr的AUC計算得生物利用度為55.02～62.31%。PCr靜注和口服后血漿中均未測出A

8、TP,但PCr靜注給藥后RBC中測出ATP,靜注PCr后,RBC中ATP的達峰時間tmax為68～83min,其消除半衰期為49～52min,當血漿中PCr濃度明顯降低時,RBC中ATP濃度仍處于較高水平,可維持300min以上;在峰值時RBC中ATP為基礎值的2倍以上。靜注PCr后RBC中未測出原藥PCr,但測出代謝物Cr,達峰時間為120min,半衰期為70min。
　　 結(jié)論:本研究建立的IP-RPHPLC法能特異地測定大

9、鼠血漿及RBC中PCr、Cr和ATP。大鼠靜注PCr的血漿動力學行為符合二室模型,其消除快速(t1/2β＜0.5h),迅即轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物Cr,轉(zhuǎn)化率達給藥量的3/5～3/4。生成的Cr的消除較PCr慢,其處置屬于消除速率限速型(ERL),即生成代謝物Cr的消除以其自身固有的速率常數(shù)進行消除,而不依賴于原形藥PCr。靜注PCr后大鼠RBC中Cr和ATP水平明顯提高,且當血中PCr濃度很低時,RBC中Cr和ATP仍處于較高水平,并維持較長時