應(yīng)用IP-RP-HPLC法研究磷酸肌酸在小鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)及代謝處置.pdf

1、目的：(1)建立一種離子對(duì)反相高效液相色譜法(IP-RP-HPLC)同時(shí)測(cè)定小鼠血漿和心肌中磷酸肌酸(PCr)及其代謝產(chǎn)物肌酸(Cr)以及相關(guān)ATP的濃度，為外源性PCr藥代動(dòng)力學(xué)和代謝處置研究提供生物分析方法學(xué)。(2)研究PCr靜注給藥后的代謝處置和代謝物動(dòng)力學(xué)。(3)研究Cr靜注給藥后的代謝處置和代謝物動(dòng)力學(xué)。
　　 方法：IP-RPHPLC色譜測(cè)定條件：固定相為Kromasil-C18色譜柱(4.6×250mm，5μm)，

2、流動(dòng)相由0.2％KH2PO4+0.08%四丁基硫酸氫銨混合溶液(PH3.0)(A)、0.2%KH2PO4+0.08%四丁基硫酸氫銨混合溶液以1NNaOH調(diào)PH7.5(B)，以及甲醇(C)組成。梯度洗脫：0～8min(100%A,1mL/min)→8～10min(85%B+15%C,1.2mL/min)→10～18min(85%B+15%C,1.2mL/min)→18～20min(80%B+20%C,1.3mL/min)→20～29min

3、(80%B+20%C,1.3mL/min)→29～30min(100%A，1mL/min)。測(cè)定波長(zhǎng)為210nm(PCr、Cr)、260nm(ATP、TMP)。血漿以及心肌樣品的預(yù)處理采用6%高氯酸沉淀蛋白，離心后的上清液立即以K2CO3中和至中性。以上操作均在冰浴低溫下進(jìn)行，以防PCr降解。選用甲氧芐啶(TMP)為內(nèi)標(biāo)，以峰面積比內(nèi)標(biāo)法定量，以基線扣除法計(jì)算外源性PCr、Cr和相關(guān)ATP。藥代動(dòng)力學(xué)研究中，小鼠靜注給藥后不同時(shí)間采血分

4、離血漿，經(jīng)預(yù)處理凈化后采用IP-RP-HPLC法分析；代謝處置研究中，小鼠靜注給藥后不同時(shí)間取心臟并勻漿，經(jīng)預(yù)處理凈化后采用IP-RP-HPLC法分析。測(cè)定上述樣品中PCr、Cr和ATP濃度。計(jì)算有關(guān)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)和轉(zhuǎn)化分?jǐn)?shù)等。
　　 結(jié)果：在上述色譜條件下，血漿及心肌中PCr、Cr、ATP及TMP均達(dá)基線分離，且不受空白基質(zhì)的干擾，PCr、Cr、ATP及TMP的tr值分別為6.2、2.9、28.8和17.3min，PCr在1～

5、7500μg/mL(血漿)、7.5～750μg/mL(心肌)，Cr和ATP在1～1500μg/mL(血漿)、7.5～750μg/mL(心肌)范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r2＞0.99)；三種分析物質(zhì)控(QC)樣品的日內(nèi)和日間精密度(RSD)分別為≤7.42%和≤8.45%(血漿)以及≤9.07%和＜9.20%(心肌)。準(zhǔn)確度在95.96～101.89%(血漿)和94.27～102.99%(心肌)；在血漿和心肌的回收率均＞90%。方法學(xué)驗(yàn)證表明該

6、法特異性強(qiáng)，精密度和準(zhǔn)確度高，符合國(guó)家藥監(jiān)局要求。靜注PCr1000mg/kg后，血漿中的PCr消除符合二室模型一級(jí)動(dòng)力學(xué)，消除半衰期t1/2β為22.95～25.35min;表觀分布容積Vd為0.96～0.98L/kg；清除率CL為0.028L/(kg·min);靜注PCr后血漿中迅即測(cè)出其降解產(chǎn)物Cr，消除類(lèi)似血管外給藥一室模型、一級(jí)動(dòng)力學(xué)，其達(dá)峰時(shí)間tmax為5min;消除半衰期t1/2k(m)為51.6～53.8min，較原藥P

7、Cr的消除半衰期長(zhǎng)；由分別靜注原藥PCr和合成代謝物后Cr所得Cr的AUC計(jì)算得Cr的生成分?jǐn)?shù)fm)為72..21%。小鼠靜注PCr1000mg/kg后心肌中未測(cè)出PCr，但測(cè)出Cr和ATP，Cr的t1/2k(m)為347.12～357.62min;達(dá)峰值時(shí)間tmax為60min;ATP的t1/2k(m)為685.46～700.54min;達(dá)峰值時(shí)間tmax為90min。小鼠靜注合成代謝物Cr456mg/kg(與PCr1000mg/kg

8、為等克分子)后，血漿中未測(cè)出高于本研究最低檢測(cè)水平的ATP,且PCr的濃度較空白血漿中內(nèi)源性PCr的濃度未有增加。血漿中的Cr消除符合二室模型一級(jí)動(dòng)力學(xué)，其消除半衰期、MRT均與給予PCr后生成的代謝物Cr的消除半衰期和MRT基本一致。小鼠靜注合成代謝物Cr456mg/kg(與PCr1000mg/kg為等克分子)后心肌中未測(cè)出高于本研究最低檢測(cè)水平的PCr，心肌中Cr和ATP的濃度均增加，且Cr及ATP的消除半衰期、MRT均與給予PCr

9、后生成的代謝物Cr及ATP的消除半衰期和MRT基本一致。小鼠腹腔注射垂體后葉素30U/kg5分鐘后再靜脈給藥PCr1000mg/kg，血漿中的PCr消除符合二室模型一級(jí)動(dòng)力學(xué)，消除半衰期t1/2β為35.22～38.12min;表觀分布容積Vd為0.95～0.97L/kg;清除率CL為0.018L/(kg·min);血漿中未測(cè)出ATP，但可迅速測(cè)出其降解產(chǎn)物Cr，消除類(lèi)似血管外給藥一室模型、一級(jí)動(dòng)力學(xué)，其達(dá)峰時(shí)間tmax為10min;消

10、除半衰期t1/2k(m)為78.9～85.7min，較原藥PCr的消除半衰期長(zhǎng)。小鼠腹腔注射垂體后葉素30U/kg5分鐘后再靜脈給藥PCr1000mg/kg，心肌中未測(cè)出PCr，但測(cè)出Cr和ATP,Cr的t1/2為293.19～297.47min;達(dá)峰值時(shí)間tmax為30min;ATP的t1/2為501.92～511.86min;達(dá)峰值時(shí)間tmax為90min。
　　 結(jié)論：本研究建立的IP-RP-HPLC法能特異地測(cè)定小鼠血漿

11、及心肌中PCr、Cr和ATP。小鼠靜注PCr的血漿動(dòng)力學(xué)行為符合二室模型，其消除快速(t1/2β＜0.5h)，迅即轉(zhuǎn)化為代謝產(chǎn)物Cr，轉(zhuǎn)化率達(dá)給藥量的3/5～3/4。生成的Cr的消除較PCr慢，其處置屬于消除速率限速型(ERL)，即生成代謝物Cr的消除以其自身固有的速率常數(shù)進(jìn)行消除，而不依賴于原形藥PCr。靜注PCr后小鼠心肌中Cr和ATP水平明顯提高，Cr和ATP在心肌中的半衰期較長(zhǎng)。小鼠靜注PCr及Cr后心肌中ATP的AUC之比為4

12、0.01%。因此我們推測(cè)小鼠心肌中的ATP水平升高主要通過(guò)兩條途徑：其一，小鼠靜脈給予外源性PCr生成代謝產(chǎn)物Cr，心肌中代謝產(chǎn)物Cr水平的提高使得相關(guān)產(chǎn)物ATP水平提高；其二，靜脈給予的PCr自身做為高耗能細(xì)胞內(nèi)ATP濃度恒定的“緩沖劑”，可以轉(zhuǎn)變成ADP磷?；鶊F(tuán)從而使ATP水平升高。小鼠靜注等克分子合成代謝物Cr后，血漿中未測(cè)出高于本研究最低檢測(cè)水平的ATP,且PCr的濃度較空白血漿中內(nèi)源性PCr的濃度未有增加，血漿中的Cr消除符合

13、二室模型一級(jí)動(dòng)力學(xué)，其消除半衰期、MRT均與給予PCr后生成的代謝物Cr的消除半衰期和MRT基本一致；心肌中未測(cè)出高于本研究最低檢測(cè)水平的PCr，心肌中Cr和ATP的濃度均增加，且Cr及ATP的消除半衰期、MRT均與給予PCr后生成的代謝物Cr及ATP的消除半衰期和MRT基本一致。小鼠腹腔注射垂體后葉素5分鐘后再靜脈給藥PCr，血漿中的PCr消除符合二室模型一級(jí)動(dòng)力學(xué)，血漿中未測(cè)出ATP，但可迅速測(cè)出其降解產(chǎn)物Cr，消除類(lèi)似血管外給藥一