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1、目的:4管內(nèi)皮細(xì)胞(vascularendothelialcells,VEC)是血管的主要結(jié)構(gòu)之一,VEC損傷導(dǎo)致的早期血栓形成是冠狀動(dòng)脈旁路移植術(shù)后移植血管狹窄的啟動(dòng)因素,促進(jìn)VEC的修復(fù)再生可有效防治移植血管狹窄。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)大鼠VECPI3Kp110β亞單位編碼基因Pik3cb,利用RNA干擾技術(shù),構(gòu)建KDR特異性啟動(dòng)子/增強(qiáng)子真核表達(dá)載體,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染大鼠VEC,探討其對(duì)大鼠VEC增殖和凋亡的影響,進(jìn)一步探索移植血管狹窄的防治方
2、法。
方法:根據(jù)Genbank中PI3Kp110β亞單位編碼基因Pik3cbmRNA序列,按照shRNA設(shè)計(jì)原則,分別構(gòu)建大鼠VEC特異性KDR真核表達(dá)載體KDR-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA和非特異性CMV真核表達(dá)載體CMV-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA。經(jīng)脂質(zhì)轉(zhuǎn)染試劑LipofectaminTM2000轉(zhuǎn)染大鼠VEC,實(shí)驗(yàn)分為5組,A組:正常VEC組;B組:轉(zhuǎn)染特異性質(zhì)粒KDR-
3、pGenesil-10-Pik3cb-shRNA組;C組:轉(zhuǎn)染非特異性質(zhì)粒CMV-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA組;D組:轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照空質(zhì)粒組;E組:陽(yáng)性對(duì)照組(wortmannin)。分別于轉(zhuǎn)染24h、48h和72h,流式細(xì)胞法檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)各組細(xì)胞Pik3cbmRNA的相對(duì)表達(dá)量,CCK-8法和流式細(xì)胞法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖和凋亡水平。
結(jié)果:轉(zhuǎn)染24h、48h和72h,轉(zhuǎn)染效率
4、分別為(35.2±4.6)%,(25.7±1.8)%和(16.7±1.6)%;實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測(cè)得KDR組Pik3cbmRNA相對(duì)表達(dá)量分別為(54.82±2.77)%,(50.54±3.98)%和(35.47±4.83)%,均明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05);CCK-8法測(cè)得KDR組細(xì)胞抑制率分別為(21.98±2.25)%,(24.32±3.04)%和(26.38±5.06)%;流式細(xì)胞法測(cè)得KDR組細(xì)胞凋亡率分別為(9.8
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