內(nèi)脂素與冠心病關(guān)系的初步研究.pdf

1、第一部分內(nèi)脂素經(jīng)核因子Κb途徑誘導(dǎo)人單核細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶-2和9表達(dá)的實驗研究目的：探討內(nèi)脂素對核因子Κb（NF-Κb）通路的激活及其在調(diào)節(jié)人單核細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的表達(dá)中的作用，以期進(jìn)一步了解內(nèi)脂素與動脈粥樣硬化的關(guān)系。
　　 方法：以健康人外周血單核細(xì)胞為研究對象。抽取健康志愿者靜脈血,分離、純化單核細(xì)胞后隨機(jī)分為空白對照組；內(nèi)脂素組（100、200、400ng/ml，24h）；Bay11-708

2、2抑制劑組（Bay11-7082 40μmol/ml預(yù)孵育30min，內(nèi)脂素400ng/ml刺激24h）。熒光定量PCR檢測各組細(xì)胞MMP-2和MMP-9mRNA的表達(dá)；Western blot檢測MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)；明膠酶譜法檢測細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)中MMP-2和MMP-9的酶活性。內(nèi)脂素刺激細(xì)胞后的核轉(zhuǎn)位分別用Western blot和ELISA進(jìn)行檢測。
　　 結(jié)果：人外周血單核細(xì)胞經(jīng)不同濃度的內(nèi)脂素干預(yù)培養(yǎng)后24h

3、單核細(xì)胞MMP-2和MMP-9mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯高于空白對照組（P均<0.05），且呈濃度依賴性。內(nèi)脂素還上調(diào)細(xì)胞分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中的MMP-2和MMP-9酶活性，內(nèi)脂素100ng/ml組MMP-9、MMP-2的酶活性分別為空白對照組的1.139±0.055和1.102±0.011倍（P均<0.05）。加入NF-Κb抑制劑Bay11-7082后MMP-2、MMP-9的Mrna、蛋白的表達(dá)及酶活性均明顯低，與內(nèi)脂素400ng/ml

4、組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P均<0.001）。內(nèi)脂素濃度越高，核蛋白NF-κBp65表達(dá)越高，內(nèi)脂素100ng/ml組相對灰度值為空白對照組的1.334±0.148倍（P均<0.05）；內(nèi)脂素濃度越高，NF-κBp65亞單位核內(nèi)轉(zhuǎn)移越多，內(nèi)脂素100ng/ml組為0.763±0.056，內(nèi)脂素400ng/ml組為1.29±0.065，均大于對照組的0.467±0.046（P均<0.05）。
　　 結(jié)論：內(nèi)脂素可通過激活NF-Κb

5、途徑上調(diào)人單核細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)及活性。這可能是內(nèi)脂素致動脈粥樣硬化及與急性冠脈綜合征密切相關(guān)的機(jī)制之一。
　　 第二部分人Visfatin基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及在THP-1細(xì)胞中的表達(dá)目的：研究增強(qiáng)型綠色熒光蛋白真核表達(dá)載體visfatin（Pegfp-visfatin）的構(gòu)建及對人THP-1細(xì)胞中脂質(zhì)吞噬的影響。
　　 方法：提取人單核細(xì)胞系THP-1細(xì)胞Visfatin的Mrna，逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)

6、（RT-PCR）擴(kuò)增Visfatin基因，克隆入Pegfp-C1載體，雙酶切、菌落PCR鑒定Pegfp-Visfatin質(zhì)粒。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Pegfp-Visfatin入THP-1細(xì)胞，分為轉(zhuǎn)染細(xì)胞組，質(zhì)粒對照組和空白對照組檢測，分析各組熒光蛋白和Visfatin基因的表達(dá)。油紅染色檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的THP-1細(xì)胞對ox-LDL的吞噬的影響。
　　 結(jié)果：成功構(gòu)建Pegfp-Visfatin質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染THP-1，轉(zhuǎn)染細(xì)胞組Visfa

7、tin Mrna的表達(dá)高于和質(zhì)粒對照組和空白對照組，（p<0.05）。油紅染色可以見組ox-LDL+Pegfp-visfatin轉(zhuǎn)染組細(xì)胞內(nèi)脂滴較未加ox-LDL孵育組及ox-LDL組（未加質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染明顯大而多。
　　 結(jié)論：重組Pegfp-Visfatin質(zhì)粒能轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞并表達(dá)Visfatin，visfatin基因能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞對脂質(zhì)的吞噬，促進(jìn)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成。
　　 第三部分冠心病患

8、者血漿內(nèi)脂素水平的初步研究目的：比較冠心病患者和正常人血漿中內(nèi)脂素(visfatin)水平,并探討血漿內(nèi)脂素是否為冠心病的危險因素。
　　 方法：收集2008年7月－2008年12月在武漢市同濟(jì)醫(yī)院心內(nèi)科就診的冠狀動脈造影陽性的冠心病患者69例：其中穩(wěn)定型心絞痛32例；急性冠脈綜合征組（ACS）37例。同期冠心病造影顯示非冠心病者中選取年齡性別與患者相匹配的24例為對照組，用ELASA法檢測各組血清visfatin水平。分析血清

9、visfatin與冠心病的關(guān)系。
　　 結(jié)果：穩(wěn)定性心絞痛組和急性冠脈綜合征（ACS）組血清vifatin水平[31.01±16.66mg/L, 46.4±19.03mg/L]明顯高于對照組[18.24±6.45mg/L]，(p<0.05, p<0.01)且ACS組和穩(wěn)定性心絞痛組之間差異也具有統(tǒng)計學(xué)意義，p<0.05。多因素Logistic回歸顯示visfatin是冠心病發(fā)病的有意義變量。
　　 結(jié)論：冠心病患者的血清