可溶性纖維介素(sfgl2)在小鼠自身免疫性肝炎中的作用及其作用機(jī)制.pdf

1、【背景及目的】
　　 自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis, AIH）是一種慢性炎癥性肝臟疾病。主要特點為：女性易患，界面性肝炎，轉(zhuǎn)氨酶升高，循環(huán)中存在自身抗體，高γ-球蛋白血癥，具有免疫易感背景，常伴有肝外自身免疫綜合征，盡管用免疫抑制劑進(jìn)行治療仍會進(jìn)展成肝硬化，甚至導(dǎo)致肝衰竭。自身免疫性肝炎是難治性肝炎，目前存在病因不明、診斷標(biāo)準(zhǔn)復(fù)雜、容易復(fù)發(fā)和預(yù)后不良等問題，并且治療上長期使用糖皮質(zhì)激素或者免疫抑制劑都

2、需要經(jīng)過縝密思考、權(quán)衡利弊，并注意隨訪觀察，給臨床工作帶來許多不便。AIH的發(fā)病機(jī)制尚不清楚，有研究表明與遺傳和環(huán)境因素有關(guān)，針對于宿主肝臟抗原的免疫反應(yīng)也被認(rèn)為是肝臟損傷的主要機(jī)制。T淋巴細(xì)胞在AIH的免疫機(jī)制中發(fā)揮了重要的作用。目前，自身免疫性肝炎的發(fā)病機(jī)制正成為全世界科學(xué)家日益關(guān)注的課題。
　　 纖維介素(fgl2)，也稱為fgl2凝血酶原酶，屬于纖維蛋白原相關(guān)蛋白超家族。有兩種類型：跨膜型fgl2和分泌型fgl2（sol

3、uble fgl2，sfgl2）。跨膜型fgl2是一種Ⅱ型跨膜型蛋白質(zhì)，其分子量大小為70kDa，主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的表面。它是一種凝血酶原酶，能夠?qū)⒛冈懈畛赡?，從而激活凝血途徑。小鼠和人的重型病毒性肝炎的肝?xì)胞損傷中均可以觀察到跨膜型fgl2誘導(dǎo)的微血管內(nèi)纖維蛋白的沉積和血栓形成，提示跨膜型fgl2在其中發(fā)揮了重要的作用。Sfgl2主要是由T淋巴細(xì)胞分泌，Chan等已經(jīng)報道了小鼠sfgl2能抑制T淋巴細(xì)胞的增殖

4、。這些結(jié)果提示sfgl2在免疫耐受方面發(fā)揮了重要作用并可能導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。然而，前期研究表明自身免疫性肝炎內(nèi)微環(huán)境中fgl2高表達(dá)的機(jī)制尚未闡明，sfgl2與自身免疫性肝炎之間的關(guān)系至今還尚未報道。
　　 研究發(fā)現(xiàn)尾靜脈高壓注射可以使質(zhì)粒DNA在小鼠肝臟獲得高效表達(dá)。尾靜脈高壓注射，就是將大體積的裸質(zhì)粒DNA溶液經(jīng)小鼠尾靜脈快速注入，大量的質(zhì)粒溶液導(dǎo)致循環(huán)血量的急劇增加，超過心臟負(fù)荷，血液積聚在肝竇中不能回流，延長了質(zhì)

5、粒DNA在肝竇中的停留時間，從而被肝組織細(xì)胞攝取。該方法可以廣泛應(yīng)用于肝臟疾病基因干預(yù)的研究。我們的前期實驗已確定構(gòu)建mfgl2反義質(zhì)粒成功地阻斷了mfgl2在細(xì)胞水平和動物體內(nèi)水平的表達(dá)，并能顯著減輕重型肝炎小鼠肝組織病理損傷，減少炎性細(xì)胞的浸潤和纖維蛋白的沉積，以及肝細(xì)胞壞死，從而最終提高重型肝炎小鼠的生存率和延長了小鼠的生存時間。我們前期研究已經(jīng)證實了mfgl2在自身免疫性肝炎小鼠模型中高表達(dá)，本研究用mfgl2反義質(zhì)粒進(jìn)行基因干

6、預(yù)自身免疫性肝炎小鼠來進(jìn)行體內(nèi)實驗，以期進(jìn)一步闡明自身免疫性肝炎的發(fā)病機(jī)制。
　　 研究表明：CD4+CD25+FoxP3+(forkhead box P3)調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（Treg）是一群專職的主動抑制針對自身抗原或外來抗原免疫反應(yīng)的細(xì)胞，在維持免疫平衡中發(fā)揮重要作用。自身免疫性肝病患者體內(nèi)的Treg數(shù)量及功能存在缺陷。自身免疫性肝炎患者體內(nèi)Treg數(shù)量減少，Treg以直接接觸的方式抑制CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖及干擾素（IF

7、N-γ）產(chǎn)生能力降低，同時產(chǎn)生IL-4、IL-10和TGF-β的能力增加。另外，膽汁性肝硬化患者外周血Treg比例降低，肝內(nèi)CD8+T淋巴細(xì)胞/FoxP3+Treg比值高于慢性HCV感染及早期自身免疫性肝炎患者，同時Treg功能也存在缺陷。這些研究結(jié)果表明Treg功能受損可能有助于自身免疫性肝病的發(fā)生，并起到加重的作用。此外，在鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus，MHV-3)誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝炎中，敏感型小鼠BALB

8、/Cj中Tregs的比例明顯上升，并且血漿中fgl2的水平也增加。體外實驗fgl2單抗完全抑制了Tregs的活性。并且用fgl2的中和抗體進(jìn)行治療能夠提高敏感型小鼠的生存率。從fgl2+/+小鼠中過繼轉(zhuǎn)移Tregs到fgl2-/-小鼠中，導(dǎo)致MHV-3感染后的小鼠的死亡率提高。闡明了fgl2是Tregs的重要的效應(yīng)性分子Treg表達(dá)的fgl2在MHV-3誘導(dǎo)的小鼠暴發(fā)性肝炎的發(fā)病機(jī)制形成中起作用。因此，研究fgl2與Tregs之間的關(guān)系

9、，以及它們在自身免疫性肝炎肝臟損傷發(fā)生機(jī)制中的作用具有十分重要的意義。
　　 具體研究目的：
　　 1. 建立自身免疫性肝炎小鼠模型，探討mfgl2在自身免疫性肝炎小鼠模型中的表達(dá)，用于自身免疫性肝炎發(fā)病機(jī)制的研究。
　　 2. 研究mfgl2反義質(zhì)粒對自身免疫性肝炎小鼠的體內(nèi)干預(yù)效應(yīng)。
　　 3. 探討可溶性纖維介素在自身免疫性肝炎小鼠模型的肝臟損傷中的分子機(jī)制。
　　 【方法】
　

10、　 1.用S-100肝抗原與弗氏完全佐劑（complete frund adjust，CFA）腹腔注入到C57BL/6小鼠體內(nèi)建立自身免疫性肝炎小鼠模型。分別于造模后的第7天、14天、21天、28天和35天處死小鼠，觀察肝臟病理組織學(xué)改變和血清ALT和AST水平來觀察肝臟的損傷程度。免疫組織化學(xué)方法和Real-Time PCR方法檢測肝臟和脾臟組織中mfgl2的表達(dá)；免疫印跡(western-blot)方法檢測脾臟混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的

11、上清和細(xì)胞中fgl2的表達(dá)；免疫組化雙染檢測小鼠肝臟中fgl2與纖維蛋白的表達(dá)，肝臟連續(xù)切片中用免疫組化法分別檢測fgl2與纖維蛋白的表達(dá)。
　　 2.利用反義RNA技術(shù)進(jìn)行體內(nèi)干預(yù)，尾靜脈高壓注射mfgl2反義質(zhì)粒，觀察小鼠血清ALT和AST水平以及肝臟病理組織學(xué)改變，分別用免疫組織化學(xué)方法和Real-Time PCR方法檢測肝臟和脾臟組織中fgl2的表達(dá)情況。
　　 3.磁珠分選方法分選出小鼠脾臟中的CD4+CD

12、25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞，Real-Time PCR方法檢測模型組、對照組、mfgl2反義質(zhì)粒和mfgl2正義質(zhì)粒中CD4+CD25+Treg細(xì)胞中mfgl2的表達(dá)情況，將CD4+CD25+Treg細(xì)胞與CD8+T淋巴細(xì)胞進(jìn)行混合培養(yǎng)，流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測fgl2對CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖抑制作用以及對其分泌的細(xì)胞因子（IFN-γ,顆粒酶和穿孔素）的表達(dá)。
　　 【結(jié)果】
　　 1.模型組小鼠血清中的ALT和AST明顯升高，

13、肝臟組織中可見大量炎性細(xì)胞浸潤和壞死形成。免疫組化觀察到模型組肝臟非實質(zhì)細(xì)胞和脾臟中有fgl2的明顯高表達(dá)。Real-Time PCR方法檢測到肝臟組織中fgl2明顯上調(diào)。Western-blot方法在脾臟淋巴細(xì)胞培養(yǎng)的上清中檢測到fgl2，而細(xì)胞沉淀中則沒有；免疫組化雙染觀測到fgl2與纖維蛋白的沉積無關(guān)，在連續(xù)切片同一部位中，觀察到fgl2的表達(dá)而沒有纖維蛋白的表達(dá)。
　　 2.尾靜脈高壓注射fgl2反義質(zhì)粒，可以觀察到fg

14、l2反義質(zhì)粒干預(yù)后小鼠血清中ALT和AST的明顯降低以及小鼠肝臟組織的病理組織學(xué)中的炎癥明顯改善，而且可以觀察到小鼠肝臟和脾臟組織中fgl2的表達(dá)明顯下降。
　　 3.Sfgl2在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞上表達(dá)，并作為其效應(yīng)性分子促進(jìn)了CD8+T淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的分泌。
　　 【結(jié)論】
　　 1.本研究發(fā)現(xiàn)mfgl2在自身免疫性肝炎小鼠模型的肝臟和脾臟中高表達(dá),上調(diào)的mfgl2與纖維蛋白的沉積無

15、關(guān)，證實了參與自身免疫性肝炎發(fā)病機(jī)制的fgl2為分泌型fgl2，并有可能通過免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)機(jī)制參與了自身免疫性肝炎的發(fā)生發(fā)展。
　　 2.本研究觀察了體內(nèi)干預(yù)自身免疫性肝炎小鼠模型后，其干預(yù)的效應(yīng)以及肝臟和脾臟組織中mfgl2的表達(dá)，為從基因水平治療與fgl2表達(dá)相關(guān)的疾病如自身免疫性肝炎、重型乙型肝炎、同種移植排斥反應(yīng)等疾病提供了理論和實驗依據(jù)。
　　 3.本研究闡明了肝臟中上調(diào)的sfgl2在自身免疫性肝炎的發(fā)病機(jī)制中起