短蛸（Octopus ocellatus）酚氧化酶的分離純化及其部分生物化學性質(zhì)的研究.pdf

1、酚氧化酶(ECl.10.3.1)能夠催化單酚羥化成二酚(如多巴)，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促條件下形成最終的反應產(chǎn)物黑色素。酚氧化酶(phenoloxidase，PO)廣泛存在于無脊椎動物和脊椎動物中。在無脊椎動物中(節(jié)肢動物和軟體動物)，PO主要參與宿主的非特異性免疫防御反應；其中在頭足類動物中則主要參與墨汁黑色素和表皮細胞色素的形成。在脊椎動物中PO主要參與皮膚色素的形成。由于PO在無脊椎動物中的重要作用，對PO的研究主要集中于無

2、脊椎動物。但到目前為止，還沒有軟體動物八腕目動物PO的研究報道。 短蛸(Octopus ocellatus)屬于軟體動物門頭足綱八腕目蛸科(章魚科)，短蛸又名八帶或短腳蛸，廣泛分布在渤海、黃海、東海、南海和日本列島等海域，是備受人類喜愛的美味動物。對短蛸酚氧化酶的分離純化和性質(zhì)研究，不僅對于認識酚氧化酶在墨汁黑色素形成過程中的生物學功能和作用機制具有重要的意義，而且還有助于我們查清其在進化中的地位。 為了揭示短蛸酚氧化酶

3、的生物化學性質(zhì)，本文以短蛸墨汁為材料，利用Sephacryl S-100凝膠過濾柱層析和DEAE Sepharose。Fast Flow離子交換柱層析等方法，對短蛸PO進行了分離純化和部分生物化學性質(zhì)研究。PO分離純化和生物化學性質(zhì)鑒定結果發(fā)現(xiàn)，短蛸PO分子量可能為153.8 kDa，含有為75.6 kDa和73.0 kDa兩個亞基。以L-二羥苯丙氨酸(L-DOPA)為特異性底物對PO活性進行研究發(fā)現(xiàn)，其最適pH值為7.0左右，最適溫度

4、為40℃左右；對底物．L-DOPA的Km值約為3.1 mmol／L，對底物兒茶酚(catechol)的K<,m>值約為6.3 mmol／L；綜合該PO能氧化L-DOPA和兒茶酚(臨苯二酚)、而不能氧化對苯二酚和酪氨酸(單酚)的實驗結果，表明該酶極可能是一種兒茶酚酶(catechol oxidase)類型的酚氧化酶。利用多種氧化酶抑制劑對PO純化樣品的酶活性進行研究發(fā)現(xiàn)，苯硫脲(phenyl thiourea)和亞硫酸鈉(sodium s

5、ulfite)對PO活性具有很強的抑制作用；抗壞血酸(ascorbic acid)、硫脲(thio urea)和檸檬酸(citric acid)、苯甲酸(benzoic acid)對PO活性也具有較強的抑制作用，而PO對半胱氨酸(cysteine)不敏感，兒茶酚酶的特異性抑制劑苯硫脲能強烈抑制短蛸PO的活性，表明該酶確為兒茶酚酶。該酶對EDTA，DETC和金屬離子非常敏感，其活性能被Cu<'2+>，EDTA和DETC強烈抑制，Mg<'2