DnaK蛋白質(zhì)的純化及其生物化學(xué)性質(zhì)分析.pdf

1、分類號：TS201密級：不保密學(xué)校代碼：10057研究生學(xué)號：12808042Dnal【蛋白質(zhì)的純化及其生物化學(xué)性質(zhì)分析ThePurificationandBiochemistI了StudyofDnaKProtein專業(yè)名稱：食品科學(xué)指導(dǎo)教師姓名：劉清岱副研究員研究生姓名：田雪利申請學(xué)位級別：工學(xué)碩士論文提交日期：2015年3月論文課題來源：自選課題學(xué)位授予單位：天津科技大學(xué)摘要熱休克蛋白70s(Heatshockproteins，Hs

2、p70s)是從細(xì)菌到哺乳動(dòng)物中均廣泛存在的一類保守的蛋白質(zhì)家族，是維持蛋白內(nèi)穩(wěn)態(tài)所必需的分子伴侶。DnaK，作為大腸桿菌中的重要的Hsp70蛋白質(zhì)，常被當(dāng)作研究Hsp70s的模型。通過分析DnaKArP復(fù)合物的空間結(jié)構(gòu)，可知其呈現(xiàn)二聚體狀態(tài)，且兩個(gè)相同的單體通過氫鍵作用力形成典型的相互作用空間，在該空間內(nèi)單體的表面結(jié)構(gòu)高度互補(bǔ)。在本實(shí)驗(yàn)中，首先依據(jù)Dn水ATP的空間結(jié)構(gòu)，通過蛋白質(zhì)交聯(lián)實(shí)驗(yàn)證明了DnaK在ATP存在時(shí)確實(shí)能夠形成特殊的二

3、聚體。為了進(jìn)一步理解此二聚體的生理意義，在二聚體的相互作用面上選擇了5個(gè)重要氨基酸分別進(jìn)行定點(diǎn)突變。體內(nèi)生長測試結(jié)果顯示四個(gè)突變R56A、T30lA、N537A、D540A均可導(dǎo)致分子伴侶活性的降低，這也就暗示了Dn擻二聚體的重要性。利用大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)上述突變蛋白質(zhì)，并采用硫酸鎳親和層析以及陰離子交換層析對其進(jìn)行純化。通過熒光偏振技術(shù)檢測突變蛋白質(zhì)與多肽底物的結(jié)合能力并與野生型Dn冰蛋白質(zhì)進(jìn)行比較，利用PRIsM軟件分析其分離常數(shù)(K

4、d)，結(jié)果顯示這些突變體并不影響DnaK原有的與多肽的結(jié)合能力。進(jìn)一步利用色氨酸特殊的熒光特性分析這些突變體是否影響ArP導(dǎo)致的Dn水變構(gòu)耦合，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所有突變體與野生型并無明顯差別，均產(chǎn)生6m左右的藍(lán)移，也就是說上述二聚體突變并不能影響ArP導(dǎo)致的變構(gòu)耦合。綜上所述，DnaK在含有ATP的環(huán)境中確實(shí)能夠形成二聚體，此二聚體結(jié)構(gòu)對分子伴侶功能的發(fā)揮意義重大。破壞二聚體空問結(jié)構(gòu)會(huì)極大地影響其分子伴侶活性，但并不影響DnaK原有的與底