基因工程仿生蜘蛛絲蛋白中重復(fù)模塊對(duì)生絲性質(zhì)的影響.pdf

1、東華大學(xué)碩士學(xué)位論文基于工程仿生蜘蛛絲蛋白中重復(fù)模塊對(duì)生成絲性質(zhì)的影響姓名：湯傳龍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：孟清2012-01-09的特點(diǎn)將這段基因分別拼接得到分別含有1 ．4 段重復(fù)序列的質(zhì)粒P E ．S c I ／2 ／3 ／4 ，在重復(fù)片段的兩端分別加上人工合成的蛛絲基因的N 端和C 端基因。將拼接得到的四段基因與I M P A C T ( I n t e i n - M e d i a t e d P

2、 u r i f i c a t i o nw i t h a n A 伍n i t yC h i t i n - b i n d i n gT a g )系統(tǒng)【5 ，6 J 的P T W I N l 質(zhì)粒融合表達(dá)得到N ．S c l ／2 ／3 ／4 ．C ．I n t e i n ．C B D 蛋白( 質(zhì)粒P 1 、- N ．S c l ／2 ／3 ／4 ．C ) ，利用幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白與幾丁質(zhì)樹脂的特異性結(jié)合親和層析得到N ．S c

3、 l ／2 ／3 ／4 ．C ．I n t e i n ．C B D 蛋白，通過(guò)加入D T T 誘導(dǎo)I n t e i n 發(fā)生N 端斷裂，得到N ．S c l ／2 ／3 ／4 ．C 蛋白。將純化的蛋白透析至p H 7 ．0 的去離子水中，利用六氟異丙醇( H F I P ) 溶劑將冷凍干燥后的蛋白按照2 0 ％的質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)回溶后，通過(guò)濕紡的手段得到四種單纖維類蜘蛛絲。組成絲纖維的四種絲蛋白單分子內(nèi)N 端和C 端非重復(fù)結(jié)構(gòu)的數(shù)量是一

4、樣的，不同的是逐漸增加的重復(fù)模塊數(shù)量。通過(guò)對(duì)四種單絲的應(yīng)力應(yīng)變測(cè)試發(fā)現(xiàn)隨著重復(fù)模塊數(shù)增多，絲纖維的延展性越好，最好的是含有四段重復(fù)模塊的絲纖維，應(yīng)變程度可以達(dá)到2 5 ％。但是纖維的抗張強(qiáng)度并不是隨著蛋白質(zhì)分子量增加一直增強(qiáng)，含有四段重復(fù)模塊的絲纖維應(yīng)力為6 0 M P a ，而含有三段重復(fù)模塊的絲纖維應(yīng)力達(dá)到了1 2 0 M P a ，是含有四段重復(fù)模塊絲纖維的兩倍，說(shuō)明重復(fù)模塊對(duì)絲纖維強(qiáng)度并不是主要影響因素。再對(duì)四種單絲進(jìn)行顯微激光

5、R a m a n 測(cè)試，分析仿生蜘蛛絲的內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)組成【7 】，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)四種重組蛛絲中，都含有Q - h e l i x 、B ．s h e e t 、B ．t u m 和m n d o mc o i l 蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)。N 端和C 端非重復(fù)模塊不是鞭毛狀絲的基因叫端、C 端和重復(fù)模塊氨基酸序列見附錄) ，主要組成Q ．螺旋、B ．折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)。四種絲纖維在蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)上，其Q ．螺旋、B ．折疊和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)含量是

6、大體一致的。鞭毛狀絲重復(fù)模塊氨基酸序列主要都是由G P G G X 的結(jié)構(gòu)組成，形成B ．t u m 二級(jí)結(jié)構(gòu)，在此基礎(chǔ)上形成B ．t u m 螺旋，該結(jié)構(gòu)能增強(qiáng)絲纖維的彈性，再次證明了鞭毛狀絲重復(fù)模塊的增加可以增強(qiáng)仿生蛛絲的延展性。本課題主要從蛋白水平和材料學(xué)水平研究重復(fù)模塊在成絲過(guò)程中的重要作用，期望能夠?yàn)楂@得性能優(yōu)越的仿生蛛絲的提供研究基礎(chǔ)，同時(shí)也對(duì)基因工程仿生蛛絲的應(yīng)用提供一種新的思路。關(guān)鍵詞：蜘蛛鞭毛狀絲，重復(fù)模塊，I M P