人胎盤源間充質(zhì)干細(xì)胞與仿生絲蛋白材料在皮膚組織工程中的運(yùn)用研究.pdf

1、在大面積皮膚缺損的治療研究中，因可用于移植的自體皮膚有限，組織工程已經(jīng)成為了解決皮膚缺損修復(fù)的“良藥”，在臨床應(yīng)用方面有著廣闊的前景。尋找良好的種子細(xì)胞和支架材料是組織工程皮膚研宄領(lǐng)域的兩大重要關(guān)鍵點(diǎn)。絲素蛋白（Silk Fibroin,SF)具有良好的生物學(xué)特性，如生物相容性、降解性、可塑性等，成為構(gòu)建組織工程皮膚的理想素材。種子細(xì)胞方面，人胎盤絨毛膜來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（Chorion MesenchymalStem cells,CM

2、SCs)具有來源方便，制取容易，增殖分化能力強(qiáng)等特點(diǎn)，有作為皮膚組織工程種子細(xì)胞的潛力。因此，本論文選取絲素蛋白（SF)納米纖維材料為支架，CMSCs為種子細(xì)胞，重點(diǎn)研究SF材料對種子細(xì)胞CMSCs生物學(xué)特性的影響，探討CMSCs與仿生SF材料的生物相容性及其在皮膚損傷修復(fù)中的作用。
　　第一部分人胎盤絨毛膜來源間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)與生物學(xué)特性鑒定
　　目的：從人足月胎盤絨毛膜中分離絨毛間充質(zhì)干細(xì)胞（CMSCs)，建立

3、相應(yīng)的擴(kuò)增體系，并對CMSCs生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。
　　方法：取健康產(chǎn)婦正常剖宮產(chǎn)足月胎兒的新鮮胎盤組織，鈍性分離羊膜層與絨毛膜層，對絨毛膜組織進(jìn)行消化及體外培養(yǎng)，倒置顯微鏡觀察體外培養(yǎng)絨毛膜間充質(zhì)干細(xì)胞(CMSCs)的細(xì)胞形態(tài)；RT-PCR分析CMSCs中干細(xì)胞基因OCT4、SOX2和NANOG的表達(dá)；流式細(xì)胞儀分別檢測其表面標(biāo)志；采用多種誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)CMSCs向脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)，并用特異性染色法對誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)

4、行鑒定。
　　結(jié)果：
　?。?)成功分離培養(yǎng)了CMSCs，體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中CMSCs呈典型的成纖維細(xì)胞樣貼壁生長，狀態(tài)良好且具有較快的增殖速度；
　?。?)RT-PCR結(jié)果顯示，CMSCs表達(dá)干細(xì)胞特性基因OCT4、SOX2和NANOG;
　　(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測體外培養(yǎng)的CMSCs高表達(dá)CD90、CD73和CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34以及MHC-II類分子HLA-DR;
　　(4)體外擴(kuò)增培養(yǎng)的

5、CMSCs成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)均由長梭形向立方形轉(zhuǎn)變，經(jīng)茜素紅S染色可見細(xì)胞集落生長并出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié);成軟骨誘導(dǎo)21天后，CMSCs在離心小管中團(tuán)聚形成小塊軟骨樣組織，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后可見陽性細(xì)胞表達(dá)I I型膠原；成脂肪誘導(dǎo)2周后，培養(yǎng)的CMSCs細(xì)胞內(nèi)有明顯的脂滴出現(xiàn)，油紅O染色陽性；CMSCs誘導(dǎo)分化為內(nèi)皮細(xì)胞21天后，在基質(zhì)膠上形成毛細(xì)血管樣結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)論：
　　通過酶消化成功獲取人CMSCs并在體外傳代擴(kuò)增，RT-PC

6、R、流式細(xì)胞術(shù)及誘導(dǎo)分化結(jié)果提示獲得的CMSCs表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)志分子并具有一定的多向分化能力，為組織工程提供良好的種子細(xì)胞。
　　第二部分仿生絲素蛋白材料與絨毛間充質(zhì)干細(xì)胞間的相容性及其在修復(fù)皮膚損傷中的作用
　　目的：
　　研究仿生絲素蛋白納米纖維對CMSCs細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，并探索其在皮膚組織損傷修復(fù)中的作用。
　　方法：
　　以天然蠶絲納米原纖結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，通過溶液濃度實(shí)現(xiàn)靜電紡纖維直徑的有效調(diào)控，獲

7、得不同納米尺度的靜電紡絲素蛋白纖維材料。應(yīng)用酶消化法從胎盤絨毛膜中提取CMSCs，并在體外培養(yǎng)和傳代擴(kuò)增后接種在不同直徑仿生絲素蛋白納米纖維材料上，培養(yǎng)不同時間后進(jìn)行檢測分析。分別采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的黏附生長及增殖情況，用CCK8法繪制生長曲線，采用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞鋪展及細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，采用流式細(xì)胞儀檢測生長于SF材料上CMSCs的表型，通過以上測試分析揭示材料微納結(jié)構(gòu)對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。選取利于細(xì)胞黏附生長維納結(jié)構(gòu)的SF

8、材料，并制作不同疏密程度的SF材料后植入大鼠皮膚損傷處，觀察記錄創(chuàng)面修復(fù)情況并通過組織切片HE染色檢測材料在皮膚損傷修復(fù)中的作用。
　　結(jié)果：
　　（1)通過改變?nèi)芤簼舛戎谱鞒霾煌睆酱笮〉姆律鶶F納米纖維支架;
　　(2)綜合運(yùn)用靜電紡絲技術(shù)、冷凍干燥技術(shù)、超聲波首次制取不同三維空間結(jié)構(gòu)的SF納米纖維材料；
　?。?)CMSCs接種于仿生SF纖維材料后，細(xì)胞正常黏附生長和鋪展并有效增殖，流式細(xì)胞儀分析接種與仿生