兔MSCs與NGF-SF-Gt支架修復糖尿病兔下頜骨缺損的實驗研究.pdf

1、目的：
　　糖尿病的發(fā)病病因是多種的，包括:免疫、微生物感染、自由基毒素、遺傳、精神等諸多因素，導致胰島素降低、胰島細胞功能減退。常見糖尿病患者會因骨量減低而導致骨質疏松和骨折發(fā)生率增加。現(xiàn)今，腫瘤切除、創(chuàng)傷、感染發(fā)生在糖尿病患者常引起骨質流失，嚴重的導致骨缺損。但是，當骨缺損發(fā)生于糖尿病患者，骨愈合緩慢，或者不愈合便成為了難以解決的問題。
　　組織工程的基本原則是綜合應用工程和生命科學，其基本理論技術和方法，植入在體外預先

2、構建的生物活性體于待修復組織缺損處，用以替代組織和器官功能。也可作為一個體外裝置，臨時性替代器官的功能，以提高生活和生存質量并延長生命活動。
　　本實驗目的是初步探討修復糖尿病兔下頜骨缺損的方法。利用組織工程的方法，通過制備絲素-明膠(SF-Gt)三維多孔共混支架并對支架性能進行檢測，通過接種人成骨細胞hFOB1.19，并添加神經生長因子后體外研究其在神經生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架三維多孔共混支架中的生長狀態(tài)及

3、對細胞粘附、增殖、分化及成骨性能的影響。此外，制備兔骨髓間充質干細胞(MSCs)的和誘導成骨后復合于神經生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架，用于修復糖尿病兔的下頜骨骨缺損區(qū)域并評估神經生長因子-絲素-明膠作為骨組織工程支架生物相容性，以及對糖尿病患者骨缺損區(qū)域的組織修復再生的作用。為進一步再構建更為理想的組織工程化復合物治療糖尿病骨缺損提供理論參數和實驗依據。
　　方法：
　　1、制備絲素-明膠(SF-Gt)多孔

4、支架，并測試SF-Gt多孔支架的孔隙率、溶脹率、吸水率、并對其機械性能進行檢測;采用掃描電鏡(SEM)和MTT的方法進一步檢測材料生物相容性。
　　2、將神經生長因子復合于絲素-明膠(NGF-SF-Gt)三維多孔支架材料;提取、傳代及擴增人成骨細胞hFOB1.19及形態(tài)學觀察并與神經生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)多孔支架以及絲素-明膠(SF-Gt)支架復合培養(yǎng);應用細胞計數法檢測細胞粘附情況、掃描電鏡(SEM)觀察、C

5、CK-8法檢測、ALP細胞活性法，研究并比較人成骨細胞在神經生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架材料和絲素-明膠(SF-Gt)三維多孔支架中的增殖、粘附、分化等成骨性能。
　　3、原代培養(yǎng)兔的骨髓間充質干細胞(MSCs)并傳代并進行觀察、計算細胞生長曲線、使用成骨誘導液進行骨誘導、并對細胞進行鑒定;復合兔骨髓間充質干細胞(MSCs)細胞于神經生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架材料中，掃描電鏡(SEM)觀察細胞

6、生長情況。
　　4、糖尿病兔模型的建立，通過兔血糖體重的變化討論糖尿病兔成模情況;兔下頜骨缺損模型的制備，并植入神經生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架及絲素-明膠(SF-Gt)三維多孔支架并設立對照組;對糖尿病兔下頜骨缺損模型修復情況進行大體和組織學觀察、并且使用影像學分析、骨小梁百分比面積測定、骨密度測定、生物力學測定、及計算機圖像分析等方法檢側其組織相容性。
　　結果：
　　1、絲素-明膠(SF-Gt)

7、三維多孔支架的孔隙率、溶脹率、吸水率及其機械性能顯示在預凍溫度為-40℃時材料的性能較符合骨組織工程的要求;通過掃描電鏡(SEM)檢測絲素-明膠(SF-Gt)三維多孔支架表面，結果顯示材呈多孔狀，細胞粘附生長有利;MTT結果顯示由京尼平交聯(lián)材料細胞毒性小于甲醇交聯(lián)材料。
　　2、人成骨細胞hFOB1.19與神經生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)三維多孔支架及絲素-明膠(SF-Gt)三維多孔支架聯(lián)合共培養(yǎng)并設立對照組;人成骨

8、細胞hFOB1.19粘附率，CCK-8定量測定和ALP活性結果顯示培養(yǎng)7天后，神經生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)組支架材料的細胞增殖，分化結果明顯高于絲素-明膠(SF-Gt)組也高于對照組的實驗結果，差異有顯著性(P＜0.05)。
　　3、骨髓間充質干細胞(MSCs)經原代培養(yǎng)及傳代后細胞密集生長，傳至第3代第3天后細胞數量急劇增加，在第6天時細胞數量增加到最高，經鑒定結果顯示加入成骨誘導液后細胞得形態(tài)發(fā)生改變可向成骨

9、細胞分化;骨髓間充質干細胞(MSCs)經原代培養(yǎng)后，我們掃描電鏡觀察材料表面，可見細胞爬行過程。
　　4、按100mg/kg靜脈注射四氧嘧啶(ALX)后，糖尿病模型的建模率為87.5％，死亡率為16.67％，證明可形成穩(wěn)定的糖尿病模型;于糖尿病兔下頜骨缺損臨界骨缺損模型，分別加入骨髓基質干細胞復合的神經生長因子-絲素-明膠(NGF-SF-Gt)支架組及該細胞復合的絲素-明膠(SF-Gt)支架組后設立對照組。術后4、8、12周進行大

10、體和組織學觀察、并且使用影像學分析、骨小梁百分比面積測定、骨密度測定、生物力學測定、及計算機圖像分析。結果表明加入材料后，12周時，含骨髓間充質干細胞的神經生長因子-絲素-明膠(MSCs-NGF-SF-Gt)多孔支架組糖尿病兔骨缺損區(qū)域的骨形成情況優(yōu)于其他組;生物力學測定結果顯示:術后4、8、12周，抗彎強度結果隨時間延長而增大，在神經生長因子-絲素-明膠(MSCs-NGF-SF-Gt)組從4周起強度開始增大。而在含骨髓間充質干細胞的的

11、絲素-明膠(MSCs-SF-Gt)組，其增大幅度平緩。而骨髓間充質干細胞復合的絲素-明膠(MSCs-SF-Gt)組及骨髓間充質干細胞復合的神經生長因子-絲素-明膠(MSCs-NGF-SF-Gt)組抗彎強度明顯高于空白對照組和糖尿病對照組，12周時，顯著性水平更為明顯(P＜0.01)。
　　結論：
　　1、本實驗成功建立絲素-明膠(SF-Gt)多孔支架模型，在預凍溫度為-40℃時材料的性能有望符合骨組織工程的需要;用京尼平交聯(lián)

12、三維共混多孔支架毒性比甲醇交聯(lián)的材料更適宜細胞生長;實驗采用京尼平交聯(lián)的絲素-明膠(SF-Gt)多孔支架材料具有較好的生物相容性。
　　2、凍干法成功將神經生長因子(NGF)復合于絲素-明膠(SF-Gt)多孔支架;神經生長因子(NGF)對人成骨細胞hFOB1.19在絲素-明膠(SF-Gt)多孔支架內的生長有明顯的促進作用。
　　3、骨髓間充質細胞(MSCs)經原代培養(yǎng)傳代后細胞生長密集，加入誘導液后細胞形態(tài)改變，向成骨細胞轉