“補(bǔ)腎生髓成肝”關(guān)鍵蛋白質(zhì)相互作用的機(jī)制研究.pdf

1、目的:研究“補(bǔ)腎生髓成肝”治則治法的生物學(xué)基礎(chǔ),分析補(bǔ)腎(左歸丸)調(diào)控骨髓間質(zhì)于細(xì)胞(MSCs)轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞這一過程中所涉及的關(guān)鍵蛋白質(zhì)靶點(diǎn),為骨髓干細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞的臨床運(yùn)用和補(bǔ)腎治療肝病提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù),進(jìn)一步揭示“腎生骨髓,髓生肝”和“肝腎同源”的科學(xué)內(nèi)涵,豐富“髓失生肝”新的病因病機(jī)和“補(bǔ)腎生髓成肝”新的治則治法,使中醫(yī)理論認(rèn)識(shí)有所突破、有所發(fā)展。
　　 方法:本研究在“補(bǔ)腎生髓成肝”治則治法理論所具有的臨床和實(shí)驗(yàn)研究

2、基礎(chǔ)上,運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思路和研究方法技術(shù)整體分析補(bǔ)腎(左歸丸)調(diào)控骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)轉(zhuǎn)化為肝細(xì)胞這一過程中蛋白質(zhì)組的差異表達(dá)、確定關(guān)鍵蛋白質(zhì),并運(yùn)用免疫共沉淀技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析研究其關(guān)鍵蛋白質(zhì)的相互作用。2 m齡Wistar大鼠(SPF級(jí))40只,隨機(jī)分為左歸丸藥物血清組和空白血清組用于制備左歸丸藥物血清,按10 ml/kg/d劑量給予左歸丸灌胃,空白組給予同等體積的生理鹽水灌胃,連續(xù)給藥15 d后頸動(dòng)脈插管取血,25

3、00rpm離心20 min,取同組上層血清混合,0.22μm微孔濾膜過濾除菌,4℃保存?zhèn)溆谩＠? d齡Wistar乳鼠獲取肝組織,肝組織貼壁培養(yǎng)法獲得原代肝細(xì)胞,傳代后種植于六孔板中作為共培養(yǎng)體系的誘導(dǎo)源細(xì)胞。引進(jìn)賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司OriCellTM Wistar大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞,復(fù)蘇培養(yǎng)后傳代于插入式培養(yǎng)皿,待細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)皿置于種有肝細(xì)胞的六孔板內(nèi),建立骨髓間質(zhì)干細(xì)胞.肝細(xì)胞共培養(yǎng)體系。共培養(yǎng)體系按組別分別加入10％

4、左歸丸藥物血清和10%空白血清,每10天更換共培養(yǎng)體系中的肝細(xì)胞1次以保證肝細(xì)胞增殖活力。插入式培養(yǎng)皿內(nèi)預(yù)先放置10%多聚賴氨酸包被的小玻片,定期收集細(xì)胞爬片用于指標(biāo)檢測。PAS法檢測共培養(yǎng)7、15、30 d時(shí)插入式培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞爬片糖原表達(dá),ICC法檢測共培養(yǎng)7、15、30d時(shí)插入式培養(yǎng)皿內(nèi)細(xì)胞爬片肝系細(xì)胞特異性標(biāo)志物AFP、CK18、ALB表達(dá),以原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞爬片作為陽性對(duì)照,傳代3次的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞爬片作為陰性對(duì)照,鏡下觀察(2

5、00×),隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞,將陽性對(duì)照片的陽性細(xì)胞率作為100%,比較兩組不同時(shí)間點(diǎn)的陽性細(xì)胞率(%)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,陽性細(xì)胞率以-X±s表示,兩樣本均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。在共培養(yǎng)15 d和30 d時(shí)收集插入式培養(yǎng)皿內(nèi)的細(xì)胞用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究,配制RIPA裂解液提取誘導(dǎo)培養(yǎng)肝細(xì)胞的總蛋白樣本,利用SDS-PAGE結(jié)合凝膠圖像分析,確定差異表達(dá)的蛋白質(zhì)條帶,用干凈的手術(shù)刀切取差異條帶進(jìn)行蛋

6、白質(zhì)質(zhì)譜分析。根據(jù)測定所得的肽段信息使用MASCOT軟件搜索Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫,比對(duì)與測定肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì),軟件自動(dòng)分析評(píng)定分?jǐn)?shù)、45分以上為有效信息。檢索NCBI公共數(shù)據(jù)庫、InterPro數(shù)據(jù)庫和UniProtKB數(shù)據(jù)庫檢索相關(guān)蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息,獲得蛋白質(zhì)家簇、區(qū)域、功能位點(diǎn)等描述以進(jìn)行生物信息學(xué)分析,確定“補(bǔ)腎生髓成肝”關(guān)鍵蛋白質(zhì)。提取正常Wistar大鼠肝組織總蛋白樣本(非變性型),利用免疫共沉淀技術(shù)檢測“補(bǔ)腎生髓成肝”

7、關(guān)鍵蛋白質(zhì)14-3-3蛋白、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、組蛋白H4的相互作用蛋白,利用SDS-PAGE結(jié)合凝膠圖像分析確定蛋白表達(dá)條帶,用干凈的手術(shù)刀切取條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析,質(zhì)譜分析結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。運(yùn)用DAVID工具分析,蛋白質(zhì)組中差異表達(dá)的蛋白給予功能注釋,并給予聚類分析和信號(hào)通路分析。給予蛋白的各種不同方式聚類分析,從PIR源數(shù)據(jù)庫給出的聚類圖。
　　 結(jié)果:骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)3d后,10%含藥血清組有

8、少部分骨髓干細(xì)胞開始表現(xiàn)出肝細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞呈多邊形、胞漿豐富、核大或多核,15d時(shí)約50%的細(xì)胞表現(xiàn)為肝細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài),30d時(shí)80%細(xì)胞呈肝細(xì)胞樣細(xì)胞形態(tài)。誘導(dǎo)培養(yǎng)30d時(shí)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)的肝細(xì)胞糖原染色陽性細(xì)胞率(81.39±3.12)大于誘導(dǎo)培養(yǎng)15d的肝細(xì)胞(19.88±2.07),差異具有顯著性、P＜0.05。誘導(dǎo)培養(yǎng)30d的肝細(xì)胞AFP陽性細(xì)胞率(3.74±0.47)顯著低于誘導(dǎo)培養(yǎng)15d的肝細(xì)胞(19.36±2.6

9、6)、P＜0.05。誘導(dǎo)培養(yǎng)30d的肝細(xì)胞CK18陽性細(xì)胞率(91.14±7.03)顯著高于誘導(dǎo)培養(yǎng)15d的肝細(xì)胞(59.21±3.61)、P＜0.05。誘導(dǎo)培養(yǎng)30d的肝細(xì)胞ALB陽性細(xì)胞率(88.72±4.35)顯著高于誘導(dǎo)培養(yǎng)15d的肝細(xì)胞(60.27±5.13)、P＜0.05。利用GIS300凝膠成像分析系統(tǒng)獲取凝膠圖像,進(jìn)行圖像分析,選定差異條帶,選取30d組中灰度值強(qiáng)于15d組和未誘導(dǎo)組的條帶進(jìn)行質(zhì)譜分析。根據(jù)質(zhì)譜分析所得肽

10、段信息檢索SwissProt56.6數(shù)據(jù)庫,種屬為大鼠,利用MASCOT軟件對(duì)各肽段評(píng)分,分值高于45為有意義信息。質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)中角蛋白、胰蛋白酶為常見干擾因素,因而從Mascot軟件檢索結(jié)果中去除角蛋白、胰蛋白酶選項(xiàng),得到初步篩選結(jié)果,結(jié)合生物信息學(xué)分析確定關(guān)鍵蛋白質(zhì)14-3-3蛋白、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、組蛋白H4作為相互作用研究的釣餌蛋白。經(jīng)免疫共沉淀反應(yīng)得到的關(guān)鍵蛋白質(zhì)相互作用蛋白結(jié)果,與H4特異性結(jié)合的蛋白有NPTX1

11、、CATA、OGG1、IMA5、Vimentin、GSTA5、TM196、、Nestin、DDX25;與GRP78特異性結(jié)合的蛋白有AL1A7、AL181、AL1A1、AL1A2、UD282,UD288,ACTB,GRK5,DPYS,GSTM1,GSTA2,GSTA3,G3P、ACSL1、ACSL5、PYC、GRP78、ECHP、TRHDE、CES3、ODP2、ARNT2、HMCS1、Nestin、CP2CN、CP2CB;與14-3-3

12、家族特異性結(jié)合的蛋白有Neuromedin-S、IMA5、EF2、CARD9、RAF1。生物信息學(xué)分析結(jié)果見附圖。
　　 結(jié)論:在本研究基于骨髓間質(zhì)干細(xì)胞-肝細(xì)胞共培養(yǎng)體系結(jié)合補(bǔ)腎(左歸丸藥物血清)進(jìn)行調(diào)控的實(shí)驗(yàn)條件下,利用蛋白質(zhì)組學(xué)的研究思路和研究技術(shù),確定“補(bǔ)腎生髓成肝”關(guān)鍵蛋白質(zhì)至少包括14-3-3蛋白、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)、組蛋白H4,與關(guān)鍵蛋白質(zhì)相互作用的蛋白質(zhì)多達(dá)30多種,這些蛋白質(zhì)的表達(dá)變化和相互作用構(gòu)