雷帕霉素通過mTOR-NF-κB-LOX-1通路抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞攝取氧化低密度脂蛋白.pdf

1、目的：
　　Ox-LDL在血管內(nèi)皮細胞的聚集與其入胞增加及入胞后的降解障礙有關，我們的前期工作發(fā)現(xiàn)雷帕霉素能夠通過增加自噬-溶酶體活性抑制人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）中氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）聚集。本研究旨在探討雷帕霉素抑制HUVECs中ox-LDL聚集的作用是否與其抑制ox-LDL的入胞有關，并探討其機制。
　　方法：
　　采用MTT檢測不同濃度雷帕霉素對細胞活力的影響，流式細胞技術檢測不同濃度雷帕霉素對

2、 Dil-ox-LDL在HUVECs聚集的影響，采用活細胞工作站觀察Dil-ox-LDL攝取入胞實時變化。定量PCR及western blot法檢測植物凝集素樣氧化低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）的轉錄及蛋白表達水平；應用瞬時轉染技術構建mTOR及NF-κB基因敲減細胞模型；運用不同的NF-κB抑制劑為工具藥抑制NF-κB活性；采用western blot法檢測mTOR，IκBα及磷酸化mTOR，IκBα的表達；采用流式細胞技術檢測抑

3、制mTOR及NF-κB對Dil-ox-LDL聚集的影響，免疫熒光觀察NF-κB亞單位p65的亞細胞分布情況；應用western blot法探討蛋白上下游關系。
　　結果：
　　1. MTT結果提示5~80nM雷帕霉素不會對細胞活力產(chǎn)生顯著影響，流式細胞技術提示雷帕霉素能濃度依賴性減少HUVECs內(nèi)Dil-ox-LDL的聚集，活細胞工作站結果進一步證實10 nM雷帕霉素能抑制Dil-ox-LDL的入胞。
　　2. ox-

4、LDL呈濃度及時間依賴性增加HUVECs LOX-1蛋白的表達。雷帕霉素能夠濃度依賴性地逆轉ox-LDL誘導的LOX-1基因、蛋白表達增加。
　　3. western blot結果提示ox-LDL能夠誘導mTOR的磷酸化（p<0.001），而雷帕霉素能夠抑制ox-LDL誘導的mTOR, p70s6k磷酸化（p<0.01），流式細胞儀結果表明敲減mTOR后也能顯著抑制Dil-ox-LDL的聚集（p<0.05）。
　　4. we

5、stern blot以及免疫熒光結果提示 ox-LDL能夠引起 IκBα的磷酸化（p<0.001），并能夠促進p65入核，而雷帕霉素則能夠抑制IκBα的磷酸化（p<0.01），并且顯著減少 p65入核，雷帕霉素單獨處理同樣能夠濃度依賴性地抑制 IκBα的磷酸化。流式細胞儀結果提示應用 NF-κB siRNA及 NF-κB抑制劑也能夠顯著抑制Dil-ox-LDL在HUVECs的聚集（p<0.01）。
　　5. Western blo

6、t結果提示運用mTOR siRNA，NF-κB siRNA以及NF-κB抑制劑均能夠顯著減少ox-LDL誘導的LOX-1蛋白表達（p<0.001），運用mTOR siRNA能夠抑制ox-LDL誘導的IκBα的磷酸化（p<0.01），然而運用NF-κB siRNA以及NF-κB抑制劑卻不能抑制mTOR的磷酸化。
　　結論：
　　雷帕霉素能夠通過mTOR/NF-κB/LOX-1通路抑制HUVECs對ox-LDL的攝取。本研究可能