內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放和CaMKⅡ-MAPK信號通路在臭氧脊髓神經(jīng)元神經(jīng)毒性的作用機制及XBP1預防靶點的研究.pdf

1、本研究從內(nèi)質網(wǎng)鈣釋放角度及后續(xù)可能的級聯(lián)反應探討臭氧引起脊髓神經(jīng)元神經(jīng)毒性的可能機制和預防該臭氧毒性可行性措施，為將來臨床上更安全有效的使用醫(yī)用臭氧提供理論依據(jù)。
　　第一部分 內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放和CaMKⅡ/MAPK信號通路在臭氧脊髓神經(jīng)元神經(jīng)毒性中的作用及其機制研究
　　目的:
　　本研究檢測體外條件下臭氧對脊髓神經(jīng)元是否具有神經(jīng)毒性，以及神經(jīng)毒性的原因是否與內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放和CaMKⅡ/MAPK信號通路有關，進一步

2、從細胞凋亡角度來探討臭氧引起脊髓神經(jīng)元神經(jīng)毒性的可能機制。
　　方法:
　　1.大鼠脊髓神經(jīng)元的原代培養(yǎng)
　　2.光學顯微鏡觀察大鼠脊髓神經(jīng)元細胞的形態(tài)，并進行MAP-2免疫熒光鑒定
　　3.CCK8法檢測不同濃度醫(yī)用臭氧對脊髓神經(jīng)元的毒性
　　4.激光共聚焦顯微鏡檢測臭氧對脊髓神經(jīng)元內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放的影響
　　用Fluo-3/AM預處理脊髓神經(jīng)元，負載后在激光共聚焦顯微鏡下檢測加入40μg/ml臭氧

3、培養(yǎng)液后鈣流峰值變化。
　　5.激光共聚焦顯微鏡檢測內(nèi)質網(wǎng)IP3/RYR信號通路是否參與臭氧誘導的鈣離子釋放
　　6.Western blotting法檢測臭氧是否通過促進內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放進一步激活CaMKⅡ和MAPK信號通路
　　Western blotting法檢測臭氧處理之后phospho-CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)的表達;
　　Western blotting法檢測臭氧處理是否引起CaMKⅡ的磷酸化，以

4、及是否與內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放有關;
　　Western blotting法檢測臭氧處理是否引起MAPK信號通路的表達情況的改變，以及是否與內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放有關。
　　7.TUNEL法檢測臭氧是否通過促進內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放、激活CaMKⅡ和MAPK信號通路誘導脊髓神經(jīng)元凋亡
　　結果:
　　1.原代培養(yǎng)新生大鼠脊髓神經(jīng)元細胞的生長情況
　　倒置相差顯微鏡下脊髓神經(jīng)元細胞核大，界限清晰，折光性強，光暈明顯，有明顯的立

5、體感，生長狀態(tài)良好。
　　2.體外培養(yǎng)大鼠脊髓神經(jīng)元鑒定
　　大鼠脊髓神經(jīng)元經(jīng)MAP-2染色后，經(jīng)細胞計數(shù)和統(tǒng)計分析所培養(yǎng)的神經(jīng)元純度為89.70±4.70％。
　　3.醫(yī)用臭氧劑量依賴性的導致脊髓神經(jīng)元神經(jīng)毒性
　　通過CCK-8比色法測定不同濃度醫(yī)用臭氧干預后脊髓神經(jīng)元的存活率。0μg/ml和30μg/ml O3不影響脊髓細胞元的存活率，而40μg/ml至100μg/ml臭氧對脊髓神經(jīng)元的神經(jīng)毒性呈劑量依賴性

6、，更高濃度的臭氧干預后脊髓神經(jīng)元存活困難。
　　4.臭氧促進脊髓神經(jīng)元內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放
　　與對照組相比，臭氧處理組加入臭氧培養(yǎng)液后，細胞內(nèi)Ca2+顯著升高(P＜0.05); EGTA（細胞外鈣離子螯合劑）預處理聯(lián)合臭氧處理組細胞內(nèi)Ca2+也顯著升高(P＜0.05)，均差異極顯著(P＜0.05）。BAPTA-AM（細胞內(nèi)鈣離子螯合劑）預處理聯(lián)合臭氧處理組與對照組相比，細胞內(nèi)Ca2+無明顯升高。Trapsi處理細胞后，細胞內(nèi)C

7、a2+瞬間顯著升高，之后鈣離子濃度趨于穩(wěn)定，再用臭氧處理，細胞內(nèi)Ca2+無顯著變化。
　　5.內(nèi)質網(wǎng)IP3/RYR信號通路參與臭氧誘導的鈣離子釋放
　　2APB或者Dantrolin單獨處理脊髓神經(jīng)元，細胞內(nèi)鈣離子濃度無變化;2APB或者Dantrolin預處理細胞后，加入臭氧培養(yǎng)液，細胞內(nèi)鈣離子濃度也無變化;臭氧單獨處理脊髓神經(jīng)元細胞內(nèi)Ca2+顯著升高，與2APB或者Dantrolin單獨處理相比，差異極顯著（P＜0.05

8、），與2APB或者Dantrolin聯(lián)合臭氧處理相比，差異極顯著（P＜0.05）。
　　6.臭氧通過促進內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放進一步激活CaMKⅡ/MAPK信號通路
　　臭氧作用于脊髓神經(jīng)元60min后，明顯增加了p38和JNK信號通路的表達水平，而ERK1/2的表達水平無明顯變化。進一步結果顯示，臭氧激活p38和JNK信號通路的表達的作用能夠被BAPTA/AM，KN62，2APB或者Dantrolene阻斷。CaMKⅡ的磷酸化與

9、p38和JNK信號通路的表達趨勢一致。
　　7.臭氧通過促進內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放、激活CaMKⅡ信號通路誘導脊髓神經(jīng)元凋亡
　　臭氧作用于脊髓神經(jīng)元后24小時，凋亡細胞的數(shù)量明顯增加。而且，臭氧誘導細胞凋亡的作用能夠被BAPTA/AM或者KN62預處理阻斷。BAPTA/AM或者KN62單獨處理不會誘導細胞凋亡。
　　結論:
　　1.醫(yī)用臭氧對脊髓神經(jīng)元有神經(jīng)毒性作用，且呈劑量依賴性。
　　2.醫(yī)用臭氧具有神經(jīng)毒

10、性，這一過程通過激活內(nèi)質網(wǎng)鈣離子釋放和CaMKⅡ/MAPK信號通路來實現(xiàn)。
　　第二部分 X-盒結合蛋白1(X-box binding protein1，XBP1)在臭氧神經(jīng)毒性保護機制中的作用研究
　　目的:
　　1.檢測臭氧處理脊髓神經(jīng)元后能否誘導內(nèi)質網(wǎng)應激;
　　2.檢測XBP1在臭氧神經(jīng)毒性過程中是否有保護作用及保護的可能機制。
　　方法:
　　1.重組腺病毒Adv-XBP1的構建和轉染

11、>　　2.重組腺病毒Adv-XBP1對脊髓神經(jīng)元XBP1過表達情況的鑒定
　　RT-PCR和Westem blotting法檢測重組腺病毒Adv-XBP1處理脊髓神經(jīng)元后內(nèi)XBP1 mRNA水平和蛋白水平表達的變化。
　　3.觀察臭氧處理之后內(nèi)質網(wǎng)應激情況和XBP1的表達
　　Western blotting法檢測臭氧作用后脊髓神經(jīng)元內(nèi)GRP、CHOP和XBP1蛋白水平表達的變化，確定臭氧對內(nèi)質網(wǎng)應激和XBP1通路的激

12、活作用。
　　4.觀察XBP1重組腺病毒是否通過減少內(nèi)質網(wǎng)應激保護臭氧誘導的細胞凋亡
　　Western blotting法檢測XBP1重組腺病毒預處理之后臭氧對脊髓神經(jīng)元內(nèi)GRP、CHOP和XBP1蛋白水平表達的影響，確定XBP1重組腺病毒對臭氧毒性的保護作用。
　　結果:
　　1.過表達腺病毒載體對脊髓神經(jīng)元轉染效率的鑒定
　　脊髓神經(jīng)元培養(yǎng)至7-8天，用不同滴度和不同持續(xù)時間的過表達腺病毒轉染，觀察轉

13、染后熒光強度的變化發(fā)現(xiàn)，最佳的轉染時間為24h，最佳的轉染滴度為80，該條件下轉染效率達到80％。
　　2.過表達腺病毒載體對脊髓神經(jīng)元XBP1過表達效率的鑒定
　　Adv-XBP1過表達腺病毒轉染脊髓神經(jīng)元之后，XBP1mRNA和相關蛋白的表達明顯增加，而Adv-LacZ轉染之后XBP1表達和對照組比較無統(tǒng)計學意義。
　　3.臭氧暴露能夠激活內(nèi)質網(wǎng)應激和XBP1的剪切
　　脊髓神經(jīng)元臭氧處理之后，GRP78和C

14、HOP蛋白的表達明顯增加。此外，實時定量PCR檢測結果顯示，醫(yī)用臭氧處理脊髓神經(jīng)元之后能夠增加XBP1mRNA的剪切，這種剪切與公認的內(nèi)置網(wǎng)應激誘導Tunicamycin誘導的內(nèi)質網(wǎng)應激相比，無統(tǒng)計學意義。另外，Western Blot結果顯示臭氧能夠明顯增加XBP1蛋白的表達。
　　4.過表達腺病毒對臭氧誘導內(nèi)質網(wǎng)應激和脊髓神經(jīng)元凋亡有保護作用
　　臭氧處理之后GRP78和CHOP蛋白的表達明顯增加，但用Adv-XBP1過

15、表達腺病毒預處理之后再用臭氧處理，GRP78和CHOP蛋白的表達較單純臭氧處理組明顯降低。Adv-XBP1過表達腺病毒預處理聯(lián)合臭氧處理脊髓神經(jīng)元與Adv-LacZ腺病毒預處理聯(lián)合臭氧處理相比，脊髓神經(jīng)元的細胞活性增加，有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:
　　1.醫(yī)用臭氧作用于脊髓神經(jīng)元能夠激活內(nèi)質網(wǎng)應激，增加XBP1的表達。
　　2.XBP1重組腺病毒能夠通過增加XBP1的表達，反饋抑制內(nèi)質網(wǎng)應激，減緩細胞凋