幾種紅樹植物的遺傳變異和抗鹽特性的分子生態(tài)學(xué)研究.pdf

1、幾種紅樹植物的遺傳變異和抗鹽特性的分子生態(tài)學(xué)研究周涵韜(廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廈門361005)中文摘耍紅樹林(Mangroves)是生長(zhǎng)于熱帶、亞熱帶陸海交匯的海灣河口潮間帶的鹽生木本植物群落，它組藏著豐富的動(dòng)植物、徽生物墓因庫(kù)，是一種珍貴的生物資源。紅樹林在維護(hù)海岸生態(tài)平街:防風(fēng)減災(zāi)、護(hù)堤保岸環(huán)境污染監(jiān)側(cè)、凈化與防治等上發(fā)揮重要的作用。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)紅樹植物開展了大盆的生物學(xué)研究工作，成果多集中在生態(tài)學(xué)，生理學(xué)，生物化學(xué)等領(lǐng)域，而分子

2、生物學(xué)領(lǐng)域的研究工作還處于起步階段。本文運(yùn)用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)不同種屬紅樹植物的遺傳變異與生態(tài)分化進(jìn)行了研究首次運(yùn)用改進(jìn)的mRNA差別顯示技術(shù)，從抗鹽能力強(qiáng)的泌鹽紅樹植物一白骨坡基因組中分離克隆了抗鹽相關(guān)荃因。同時(shí)運(yùn)用蛋白質(zhì)雙向電脈球術(shù)，從白骨坡葉片中分離了抗鹽相關(guān)蛋白質(zhì)，并初步分析了該蛋白質(zhì)的生化特性。1具體結(jié)果如下:1.采用改良的CTAB抽提方法，成功地從不同種屬紅樹植物的葉片中提取和純化了基因組DNA。獲得的DNA純度較好認(rèn)

3、二。A28。在1.61.8之間)，得率高(平均得率約為1201gDNAgF.W.)，片段完整(片段大小約為23Kb左右).適宜于進(jìn)行PCR擴(kuò)增及后續(xù)分子生物學(xué)研究.說明本文首次在前人工作基礎(chǔ)上加以改進(jìn)的CTAB法，廣泛適用于富含單寧、多糖、脂類、膠質(zhì)類物質(zhì)等的紅樹植物基因組DNA的提取與純化。RAPD擴(kuò)增反應(yīng)的穩(wěn)定性、重復(fù)性及擴(kuò)增帶型的豐富性是進(jìn)行紅樹植物遺傳多樣性分析的基礎(chǔ)。使用德國(guó)Biometra公司T3型PCR儀，規(guī)范實(shí)臉操作，采

4、用如下反應(yīng)體系:10mmolLTrisHC1PH8.050mmolLKCI0.01%明膠，80ng模板DNA2mmolLMgC120.2mmolLdNTPs0.21molL10核普酸隨機(jī)引物，0.5UTaqDNA聚合醉，總休積251L。擴(kuò)增程序?yàn)?94C變性lmin36C退火lmin720C延伸2min，共進(jìn)行4。個(gè)循環(huán)，最后72C延伸7min。獲得的RAPD擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定性高，重復(fù)性好，擴(kuò)增帶型豐富平均為67條。2.以福建九龍江口龍海紅

5、樹林自然保護(hù)區(qū)浮宮種苗園內(nèi)白骨坡(Avicenniamarina)桐花樹(Aegicerascorniculatui)、無(wú)瓣海桑(Sonneratiaapetala)、秋茄(Kandeliacandel)、木祖(Bruguieragyanorrhiza)、海蓮(BruguieraSexangula)、尖瓣海蓮(Bruguierasexangulavar.rhynchopetala)等7種紅樹植物為材料，運(yùn)用RAPD技術(shù)對(duì)這7種紅樹植物進(jìn)

6、行了遺傳多樣性分析。從30個(gè)10核普酸隨機(jī)引物中篩選出15個(gè)有效引物。利用這15個(gè)有效引物共擴(kuò)增出630條DNA帶，其中多態(tài)性條帶535，占總擴(kuò)增條帶的84.92%.利用Nei指數(shù)法得出7種紅樹植物間58.01%。Nei指數(shù)法分析和UPGMA統(tǒng)計(jì)分析表明，6種海桑屬紅樹植物分為ABC三個(gè)組，平均遺傳距離為0.38A組包括無(wú)瓣海桑、海南海桑、卵葉海桑、杯粵海桑。其中無(wú)瓣海桑、海南海桑、卵葉海桑處于同一個(gè)組。B組包括擬海桑。C組包括海桑。目

7、前無(wú)瓣海桑己引種到福建九龍江口，對(duì)海南和福建無(wú)瓣海桑種群進(jìn)行RAPD分析。Shannons表型多樣性指數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，福建種群為。669，海南種群為0.671.各種群遺傳變異較大，這與無(wú)瓣海桑種群廣泛的適應(yīng)性相一致。種群間的Shannons表型多樣性指數(shù)分析表明，種群內(nèi)的遺傳變異占整個(gè)遺傳變異的93.3，而亞種群間的遺傳變異僅占6.7%?？梢?，無(wú)瓣海桑種群的大部分遺傳變異存在于種群內(nèi)，而亞種群間的遺傳變異較小。由此可見，無(wú)瓣海桑基因組豐

8、富的多樣性，是使其由海南成功引種到福建的重要因素。本文同時(shí)探討了與無(wú)瓣海桑遺傳距離較近的海南海桑(0.32)和卵葉海桑(0.26)，作為海桑屬紅樹植物進(jìn)一步由海南向福建引種的可能性。5.建立起適合于紅樹植物簡(jiǎn)便、快速的.RNA差別顯示系統(tǒng)。在福建九龍江口龍海紅樹林自然保護(hù)區(qū)浮宮種苗園采集白骨坡的隱胎生種子，在實(shí)驗(yàn)室分別置于00.60鹽度海水(自來水)和50編鹽度海水進(jìn)行沙培。分別取葉片，提取純化RNA。利用所建立的。RNA差別顯示系統(tǒng)，

9、通過8個(gè)10核昔酸隨機(jī)引物PCR擴(kuò)增，篩選抗鹽相關(guān)基因。8%非變性聚丙烯酸膠凝膠電泳后，經(jīng)比較高鹽(50%u鹽度海水沙培)和無(wú)鹽(0%鹽度海水沙培)條件下白骨坡mRNA差別顯示的電泳圖譜，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)差異DNA片段。這3個(gè)片段只在高鹽培養(yǎng)條件的白骨鑲基因組中表達(dá)，而在低鹽培養(yǎng)條件中沒有出現(xiàn)。這些差異DNA片段可能就是抗鹽相關(guān)荃因，分別命名為csrgl(6006p)csrg2(550bp)、csrg3(480bp)回收3個(gè)差異DNA片段，再

10、次用相應(yīng)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用6核普酸隨機(jī)引物和同位素標(biāo)記該差異DNA片段，然后分別與高鹽條件培養(yǎng)和無(wú)鹽條件培養(yǎng)下白骨坡葉片的RNA進(jìn)行雜交。結(jié)果顯示，只有csrgl在高鹽和無(wú)鹽條件下有明顯差異(高鹽中有雜交斑點(diǎn)，無(wú)鹽中無(wú)雜交斑點(diǎn))其余2個(gè)片段在高鹽和無(wú)鹽條件下都沒有雜交斑點(diǎn)出現(xiàn)。從而表明csrgl就是抗鹽相關(guān)基因。進(jìn)一步將csrgl片段克隆，并進(jìn)行DNA序列分析。結(jié)果表明，csrgl片段全長(zhǎng)為5936p，并獲得其酶切物理圖譜。全序

11、列在基因Bank中查詢后，未發(fā)現(xiàn)相關(guān)同源基因?？果}相關(guān)DNA片段的獲得，將為分離全長(zhǎng)抗鹽基因，搞清該荃因表達(dá)調(diào)控的機(jī)理提供條件。6.在進(jìn)行白骨坡抗鹽相關(guān)基因篩選的同時(shí)，運(yùn)用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)試圖分離抗鹽相關(guān)的蛋白質(zhì)。分別從高鹽條件培養(yǎng)(50060鹽度海水)和無(wú)鹽條件培養(yǎng)(0%鹽度海水)下白骨坡葉片中抽提總蛋白質(zhì)。利用美國(guó)BioRad公司雙向電泳系統(tǒng)，在相同的條件下同時(shí)進(jìn)行雙向電泳。第一向?yàn)榈入娋劢闺娪?pH310)，第二向?yàn)镾DSPAG