富貴竹黑腐病拮抗菌H5的篩選、鑒定及其發(fā)酵產(chǎn)物研究.pdf

1、從紅樹(shù)林中篩選出一株對(duì)富貴竹黑腐病(AspergiIlusnigerV.Tiegh.)有拮抗作用的菌株H5,對(duì)該菌株進(jìn)行了初步鑒定及發(fā)酵條件研究，初步探討了菌株的抑菌機(jī)制及發(fā)酵液的穩(wěn)定性，并從其發(fā)酵液中得到了一種對(duì)黑曲霉具拮抗作用的蛋白。 對(duì)湛江特呈島紅樹(shù)林植物紅海欖(Rhizophorastylosa)、木欖(B.gymnorrhiza)、白骨壤(Auicenniamarina)等幾種紅樹(shù)植物的根、莖、葉樣品進(jìn)行拮抗細(xì)菌的分離

2、和篩選，以黑曲霉(AspergillusnigerV.Tiegh.)為靶標(biāo)微生物，通過(guò)對(duì)峙培養(yǎng)法從中篩選出有拮抗作用的細(xì)菌17株，其中從紅海欖(Rhizophorastylosa)根部得到的菌株H5表現(xiàn)較強(qiáng)的平板抑菌能力：對(duì)峙平板試驗(yàn)中，抑菌帶寬度達(dá)10.1mm，管碟法測(cè)定試驗(yàn)中抑菌圈平均直徑達(dá)24mm，生長(zhǎng)速率法顯示發(fā)酵液原液對(duì)黑曲霉菌絲生長(zhǎng)抑制率達(dá)到91.9％。 根據(jù)Biolog自動(dòng)鑒定系統(tǒng)，H5與系統(tǒng)給定的菌株地衣芽孢桿菌

3、(Bacilluslicheniformis)的相似性系數(shù)為0.830，距離2.41。通過(guò)16SrDNA序列分析對(duì)菌株進(jìn)行鑒定，所測(cè)定的序列結(jié)果通過(guò)多序?qū)Ρ蕊@示菌株H5與枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌的相似性均為99％，與Biolog鑒定相結(jié)合初步鑒定菌株為地衣芽孢桿菌。 以發(fā)酵液的菌量及抑菌活性為指標(biāo)，研究了碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌株H5生長(zhǎng)和抑菌活性的影響并對(duì)該菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)單因子試驗(yàn)和正

4、交試驗(yàn)獲得菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的最佳發(fā)酵配方及條件為：即牛肉膏8g，蛋白胨4g，乳糖12g，氯化鈉3g.起始pH值6.0-7.0，溫度28-32℃，裝液量20-50ml/250ml，培養(yǎng)時(shí)間72～84h，抑菌圈直徑最高可達(dá)26mm。 抑菌機(jī)理的研究結(jié)果表明拮抗菌H5對(duì)黑曲霉病菌菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有明顯的抑制作用，處理后菌絲分枝異常，菌絲原生質(zhì)濃縮，頂端胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，菌絲的生長(zhǎng)受到抑制，其無(wú)菌濾液可以顯著降低孢子萌發(fā)率，抑制芽管伸長(zhǎng)。

5、該菌株不產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶，通過(guò)分泌抑菌物質(zhì)起抑菌作用。H5菌株的無(wú)菌濾液對(duì)熱、對(duì)酸堿均具有較好的穩(wěn)定性。 無(wú)菌濾液經(jīng)飽和度60％硫酸銨沉淀后，粗提物具較強(qiáng)的抑菌活性。抗菌物質(zhì)經(jīng)121℃處理20min仍能保持約80％抑菌活性，經(jīng)胰、胃蛋白酶處理后，抑菌活性無(wú)明顯變化，抗菌活性物質(zhì)可能主要是一類對(duì)熱穩(wěn)定的蛋白質(zhì)類物質(zhì)，經(jīng)SephadexG-100柱層析收集各管并測(cè)定各組分抑菌活性，有抑菌活性的組份經(jīng)SDS-PAGE電泳顯示單一條帶，從發(fā)