黃酮類化合物對溶菌酶淀粉樣纖維化過程的抑制作用研究.pdf

1、蛋白的聚集會導(dǎo)致蛋白空間構(gòu)型發(fā)生變化，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)喪失正常的生物學(xué)功能，聚集形成的纖維體會沉積在細(xì)胞中，引起細(xì)胞功能障礙，最終導(dǎo)致組織器官發(fā)生病變，引發(fā)各種疾病，如老年癡呆癥、Ⅱ型糖尿病、帕金森綜合癥、阿爾茲海默癥等。研究藥物分子對蛋白淀粉樣纖維化過程的抑制作用，對疾病的預(yù)防和治療以及新藥的開發(fā)研究具有重要意義。研究表明，天然的酚類化合物具有潛在的抑制蛋白纖維化的作用。黃酮類化合物是一類廣泛存在自然界的天然酚類物質(zhì)，但目前關(guān)于此類化合

2、物對蛋白聚集抑制作用的研究主要集中于兒茶酚類黃酮化合物的研究。溶菌酶是第一種作為疾病標(biāo)志物的蛋白質(zhì)，是己知能夠形成淀粉樣纖維的球形蛋白經(jīng)典模型，因此，本研究選擇了18種結(jié)構(gòu)不同的非兒茶酚類黃酮，以雞蛋清溶菌酶為體外研究模型，通過條件的考察，建立了溶菌酶聚集纖維化研究模型，在建立的模型的基礎(chǔ)上，利用8-苯胺基-1-奈磺酸（ANS）、硫黃素T(ThT)、剛果紅探針技術(shù)，圓二色譜（CD），透射電鏡等研究了上述黃酮類化合物對溶菌酶纖維化過程中疏

3、水區(qū)暴露、β片層折疊增加過程的抑制作用；通過分子對接技術(shù)，對上述黃酮類化合物對溶菌酶聚集的抑制作用機(jī)理進(jìn)行了初步探討，所獲結(jié)果對于我們探究黃酮類化合物蛋白聚集抑制劑的篩選和分子機(jī)理探討提供了有益的參考和依據(jù)。具體內(nèi)容如下：
　　1.溶菌酶自聚集纖維化過程體系的構(gòu)建及表征
　　以ThT為熒光探針，考察了不同pH、溫度、有機(jī)溶劑濃度以及放置時間對溶菌酶聚集情況的影響，確定了溶菌酶自聚集纖維化過程研究的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，研究表明?0μM

4、雞蛋清溶菌酶在含0.5％的DMSO pH2.0的甘氨酸-HCl緩沖溶液中，恒溫溫度65℃下，放置16天，可以完成自聚集，成長為淀粉樣纖維，生長曲線呈S型，成長過程是一個成核—纖維延長—纖維成熟的動力學(xué)過程。在確定的條件下，通過ANS熒光探針法、剛果紅紫外探針法、CD光譜以及TEM檢測了溶菌酶纖維化過程中疏水區(qū)域暴露和β片層折疊結(jié)構(gòu)的變化情況，結(jié)果顯示隨著溶菌酶纖維化過程的加劇，其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，α螺旋結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)棣缕瑢诱郫B結(jié)構(gòu)，

5、疏水區(qū)域暴露加劇，由均一的溶液逐漸成長為長的絲狀纖維。
　　2.黃酮類化合物對溶菌酶自聚集纖維化過程的影響研究
　　在相同實(shí)驗(yàn)條件下，將與溶菌酶不同濃度比例（1:1,1:0.5,1:0.2）的黃酮類化合物加入溶菌酶樣品中一起孵育，采用ThT、ANS熒光法、剛果紅吸收法、CD、透射電子顯微鏡檢測黃酮類化合物對溶菌酶聚集的影響。結(jié)果顯示，加入黃酮類化合物的溶菌酶溶液，與成熟纖維的ThT熒光強(qiáng)度、ANS熒光強(qiáng)度以及剛果紅吸收強(qiáng)度相

6、比，都有不同程度的降低，降低的程度與加入的黃酮化合物的濃度呈正相關(guān)；CD光譜顯示，加入黃酮類化合物后，聚集過程中β片層結(jié)構(gòu)的吸收逐漸減小，α螺旋結(jié)構(gòu)吸收逐漸增多；TEM形貌觀察顯示，加入黃酮類化合物后的溶菌酶纖維變短，變細(xì)。在這18種黃酮類化合物中；葛根素、柚皮素、槐角苷、槲皮素，水飛薊賓、柚皮苷、白楊素、黃芩苷、黃芩素、木犀草素都顯示出了較強(qiáng)的抑制溶菌酶聚集纖維化的作用，在1:1濃度比例下，對溶菌酶聚集過程的疏水區(qū)暴露及β片層增多的抑

7、制率均達(dá)到70%以上，顯示了較強(qiáng)的抑制作用。
　　3.分子對接法研究黃酮類化合物與溶菌酶的相互作用
　　由上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，黃酮類化合物對溶菌酶聚集的抑制作用主要發(fā)生在溶菌酶纖維化形成的前期，意味著黃酮類化合物對溶菌酶的聚集抑制主要來源于黃酮類化合物與溶菌酶單體之間的相互作用，因此，我們以2LYZ的三維空間結(jié)構(gòu)作為模型蛋白，用Autodock4.0軟件對溶菌酶與黃酮類化合物分子進(jìn)行分子對接，分子對接的研究結(jié)果顯示，黃酮類化