幾種補(bǔ)腎調(diào)肝中藥促排卵機(jī)制及臨床研究.pdf

1、研究背景:多囊卵巢綜合征(ploycystic ovarian syndrome PCOS)是導(dǎo)致排卵障礙的最常見的原因,該病以無排卵、卵巢多囊性改變和高雄激素血癥或高雄激素表現(xiàn)為主要特征,臨床表現(xiàn)多樣。包括月經(jīng)異常(月經(jīng)稀發(fā)、閉經(jīng)、功能失調(diào)性子宮出血)、不孕、多毛、痤瘡、肥胖、多棘皮癥等,并常伴胰島素抵抗、高胰島素血癥及高脂血癥；其中9-30％的患者還伴有血清催乳素水平增高。該病還與早期妊娠丟失、妊娠晚期合并癥及卵巢癌等泌尿生殖系惡性

2、腫瘤的發(fā)病等有一定的關(guān)聯(lián)。目前對(duì)于該病的發(fā)病機(jī)制及診斷尚存在不少爭(zhēng)議。目前西醫(yī)治療PCOS的主要的手段有:飲食控制、藥物治療及手術(shù)治療。但有部分患者在規(guī)范的西醫(yī)治療后仍未能獲得滿意的臨床結(jié)局。
　　 中醫(yī)中藥從“腎、肝”等論治取得不錯(cuò)的臨床療效。只是目前關(guān)于中藥促排卵大多數(shù)依舊是經(jīng)驗(yàn)用藥,缺乏實(shí)驗(yàn)依據(jù),臨床應(yīng)用時(shí)可重復(fù)性差等不足；邢福祺教授先前的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)提示一些藥物如仙茅、巴戟天、肉蓯蓉、菟絲子、淫羊藿、熟地黃、枸杞子等七味補(bǔ)腎

3、中藥顯著性增加大鼠垂體細(xì)胞分泌FSH的量,芍藥、甘草、仙茅、巴戟天等四味中藥能顯著降低大鼠垂體前葉細(xì)胞催乳素的分泌量。本研究依據(jù)先前的實(shí)驗(yàn)依據(jù),并依據(jù)中醫(yī)從“腎、肝”論治排卵障礙的理論,選取仙茅、巴戟天、菟絲子、淫羊藿、白芍藥及甘草等六味藥合用,探討上述六味藥物對(duì)排卵障礙小鼠的促排卵作用和機(jī)制。并觀察上述藥物在多囊卵巢綜合征患者中的臨床療效。
　　 第一章:幾種補(bǔ)腎調(diào)肝中藥促卵泡發(fā)育機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究
　　 目的:利用排卵障

4、礙模型小鼠,觀察仙茅、巴戟天、菟絲子、淫羊藿、白芍藥及甘草等六味補(bǔ)腎調(diào)肝中藥對(duì)子宮及卵泡發(fā)育的影響,并初步探討上述中藥可能的促卵泡發(fā)育機(jī)制。
　　 方法
　　 1.無排卵小鼠模型的建立與分組:選擇5日齡雌性昆明小鼠120只,隨機(jī)選擇100只于頸背部皮下注射丙酸睪丸酮0.04ml(1ml:25mg),其余20只小鼠相同部位皮下注射等量中性茶油0.04mL,作為對(duì)照(F組)。將注射過丙酸睪丸酮的小鼠隨機(jī)分為5組,A組為低劑量

5、中藥處理組,B組為中等劑量中藥處理組,C組為高劑量中藥處理組,D組為克羅米芬對(duì)照組,E組為模型組；A、B、C、D、E組小鼠自8周齡大小時(shí)開始每日取陰道脫落細(xì)胞涂片鏡下觀察,連續(xù)十日,涂片出現(xiàn)持續(xù)性角化細(xì)胞提示造模成功。
　　 2.給藥方法:造模成功后開始每日灌胃,A組小鼠每日0.5g/ml中藥0.5ml灌胃,連續(xù)10天,B組小鼠每日1g/ml中藥0.5ml灌胃,連續(xù)10天,C組小鼠每日2g/ml中藥0.5ml灌胃,連續(xù)10天,D

6、組小鼠每日1.2mg/ml枸櫞酸克羅米芬0.5ml灌胃,連續(xù)10天,E、F組每日蒸餾水0.5ml灌胃連用10天。
　　 3.標(biāo)本的獲取:所有小鼠均與最后1次灌胃后24小時(shí)稱重,后摘取眼球取動(dòng)靜脈血約1.0ml于促凝采血管中,離心后分離血清,并保存在4℃冰箱中待檢測(cè)。采血后頸椎脫臼法處死小鼠,常規(guī)消毒后逐層剪開小鼠腹壁、腹膜,順子宮向上找到小鼠卵巢組織,剪下小鼠子宮及卵巢,剔除周圍筋膜及脂肪組織,標(biāo)本稱重,稱重后經(jīng)標(biāo)記迅速投入4％

7、甲醛溶液中固定。同時(shí)計(jì)算每只小鼠的子宮指數(shù)(mg/100g)及卵巢指數(shù)(mg/100g)。
　　 4.激素的測(cè)定及免疫組化檢測(cè)生長(zhǎng)分化因子-9(growth differentiation factor9GDF-9)的表達(dá):放射免疫法測(cè)定小鼠血清雌二醇及卵泡刺激素濃度,常規(guī)防脫石蠟切片,免疫組織化學(xué)法(SABC法)測(cè)定小鼠卵巢中生長(zhǎng)分化因子-9的表達(dá),每組均設(shè)一切PBS代替一抗作空白對(duì)照。并按以下標(biāo)準(zhǔn)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行判讀:采用

8、盲法閱片。陽性判斷標(biāo)準(zhǔn):每張染色片隨機(jī)選取5個(gè)視野,以背景清晰,細(xì)胞質(zhì)著色呈棕黃色為陽性反應(yīng),據(jù)陽性顆粒的強(qiáng)度及陽性細(xì)胞的比例進(jìn)行如下判斷,并分為(-)、(+)、(++)、(+++)4個(gè)等級(jí)。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS19.0分析,計(jì)量資料用x±sd表示,計(jì)數(shù)資料用率表示；計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),對(duì)呈正態(tài)性分布和方差齊同的數(shù)據(jù),進(jìn)行方差分析；對(duì)不呈正態(tài)性分布和方差不齊的數(shù)據(jù)使用基于方差不齊

9、的近似方差分析。兩兩間的比較采用LSD法(方差齊性)或Dunnett-T3法(方差不齊)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用行×列表的多個(gè)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05,結(jié)果以P<0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果
　　 1.各組小鼠間卵巢指數(shù)、子宮指數(shù)及血清FSH、E2水平等均存在顯著性差異。采用LSD法進(jìn)行兩兩比較時(shí)發(fā)現(xiàn),克羅米芬組與中藥組血清FSH顯著高于模型組小鼠。各組間血清雌二

10、醇濃度均存在顯著性差異,其中克羅米芬組>高劑量中藥組>中劑量中藥組>低劑量中藥組>空白對(duì)照組>模型組；子宮指數(shù)中劑量中藥組與高劑量中藥組之間及克羅米芬組與空白對(duì)照組之間無顯著性差異(P值均為1.000),其他各組間均存在顯著性差異(P<0.05),其中中高劑量中藥組>低劑量中藥組>克羅米芬組與空白對(duì)照組>模型組；中劑量中藥組、高劑量中藥組及克羅米芬組卵巢指數(shù)顯著低于模型組(P<0.01)。
　　 2.模型組可見較多原始卵泡,多呈

11、囊性擴(kuò)張,生長(zhǎng)卵泡數(shù)目較少。中藥組及克羅米芬組見生長(zhǎng)卵泡數(shù)目明顯增多,發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)卵泡及成熟黃體,卵泡未見明顯的囊性擴(kuò)張。經(jīng)多樣本非參數(shù)檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各組卵泡的卵泡構(gòu)成比有顯著性差異(卡方值為22.561,P值為0.000)。
　　 3.各組間GDF-9免疫組化染色強(qiáng)度有顯著性差異(卡方值為48.072,P值為0.000),中藥組GDF-9免疫組化染色強(qiáng)度高于模型組。
　　 結(jié)論
　　 1.對(duì)5日齡雌性小鼠使用丙酸睪丸酮皮

12、下注射成功造小鼠雄激素所致不孕(排卵障礙)模型2.仙茅、巴戟天、菟絲子、淫羊藿、白芍藥及甘草等六味補(bǔ)腎調(diào)肝中藥對(duì)排卵障礙小鼠具有促卵泡發(fā)育的作用3.上述六味補(bǔ)腎調(diào)肝中藥能上調(diào)排卵障礙模型小鼠卵母細(xì)胞生長(zhǎng)分化因子-9表達(dá),這可能是上述補(bǔ)腎調(diào)肝中藥促卵泡發(fā)育的機(jī)制之一。
　　 第二章：幾種補(bǔ)腎調(diào)肝中藥用于多囊卵巢綜合征患者促排卵的臨床研究
　　 目的:探討仙茅、巴戟天、菟絲子、淫羊藿、白芍藥及甘草等6味補(bǔ)腎調(diào)肝中藥應(yīng)用于PC

13、OS患者中促排卵的作用,比較上述補(bǔ)腎調(diào)肝中藥與枸櫞酸克羅米芬及來曲唑等常用促排卵藥物臨床結(jié)局的差異。
　　 方法
　　 1.研究對(duì)象:2008年12月至2010年12月就診于南方醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心診斷為多囊卵巢綜合征(參考2007年日本婦產(chǎn)科學(xué)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn))并要求促排卵指導(dǎo)同房的患者。均經(jīng)子宮輸卵管造影或者腹腔鏡檢查證實(shí)至少一側(cè)輸卵管通暢,男方精液密度≥20×106/ml,活動(dòng)率a+b％≥30％。經(jīng)排除標(biāo)準(zhǔn)排除后符合入組條件

14、患者111例。
　　 2.研究資料分組:所有患者隨機(jī)(隨機(jī)表法)分為A、B、C三組,A組為補(bǔ)腎調(diào)肝中藥治療組(仙茅20克、巴戟天20克、菟絲子20克、淫羊藿10克、白芍藥20克、甘草10克服用時(shí)將上顆粒制劑一并倒入100ml熱開水后分兩次服用),B組為枸櫞酸克羅米芬組(100mg×5d),C組為來曲唑治療組(5mg×5d)。A組患者38例,共完成101個(gè)促排卵周期治療；B組患者37例,共完成102個(gè)促排卵周期治療；C組患者36例

15、,共完成101個(gè)促排周期。
　　 3.主要觀察指標(biāo):hCG日血清雌二醇、血清催乳素濃度,hCG日子宮內(nèi)膜厚度,hCG日成熟卵泡數(shù)(卵泡徑線≥14mm),排卵率,臨床妊娠率,多胎妊娠率及卵巢過度刺激綜合征發(fā)生率等。
　　 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:數(shù)據(jù)均用統(tǒng)計(jì)軟件包SPSS19.0分析,計(jì)量資料用(x)±sd表示,計(jì)量資料先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),對(duì)呈正態(tài)性分布和方差齊同的數(shù)據(jù),進(jìn)行方差分析；對(duì)不呈正態(tài)性分布和方差不齊的數(shù)據(jù)使

16、用基于方差不齊的近似方差分析。兩兩間的比較采用LSD法(方差齊性)或Dunnett-T3法(方差不齊)檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率(％)表示,采用行×列表的多個(gè)樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)檢驗(yàn)(Kruskal-Wallis檢驗(yàn))。檢驗(yàn)水準(zhǔn)取α=0.05,結(jié)果以P<0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果
　　 1.基本信息的比較:中藥組、枸櫞酸克羅米芬組與來曲唑組之間患者年齡、不孕年限、原發(fā)不孕比例、體重指數(shù)、血清基礎(chǔ)性激素(含黃體生成素、卵泡刺

17、激素、睪酮、催乳素、雌二醇)等均無顯著性差異；
　　 2.hCG日激素水平、成熟卵泡數(shù)及子宮內(nèi)膜厚度等比較:中藥組、枸櫞酸克羅米芬組及來曲唑血清雌二醇水平分別為:381.1±134.5pg/ml、759.0±506.4pg/ml、560.3±259.9pg/ml；血清催乳素分別為:16.75±9.29pg/ml、24.48±17.72pg/ml、25.22±18.93pg/ml；成熟卵泡數(shù)(≥14mm)分別為1.35±0.71、

18、2.77±1.69、1.89±0.91；子宮內(nèi)膜厚度分別為:10.01±2.19mm、8.69±2.04mm、8.81±2.07mm:進(jìn)行比較時(shí)發(fā)現(xiàn)3組患者之間的血清雌二及催乳素水平、成熟卵泡數(shù)及子宮內(nèi)膜厚度有顯著性差異,進(jìn)行兩兩比較時(shí)發(fā)現(xiàn)中藥組顯著低于其他兩組,成熟卵泡數(shù)中藥組顯著低于其他兩組,子宮內(nèi)膜的厚度顯著高于枸櫞酸克羅米芬組與來曲唑組(P值均小于0.001);
　　 3.排卵率及臨床妊娠率等指標(biāo)的比較:中藥組、枸櫞酸克

19、羅米芬組及來曲唑組的累積排卵率分別為67.3％、69.6％、63.4％,卡方值為0.994,P值為0.608,無顯著性差異；累積妊娠率分別為:31.6％、35.1％、30.6％,卡方值為0.192,P值為0.908,無顯著性差異。每一周期的排卵率及臨床妊娠率也無顯著性差異；中藥組患者無多胎妊娠發(fā)生,1名患者B超下證實(shí)為異位妊娠,枸櫞酸克羅米芬組患者多胎妊娠率為23.1％(3例),其中有7.7％(1例)患者為三胎妊娠,來曲唑組患者多胎妊娠

20、率為18.2％(2例),3組之間無顯著性差異(卡方值為0.975,P值為0.614)。
　　 結(jié)論
　　 1.仙茅、巴戟天、菟絲子、淫羊藿、白芍藥及甘草等補(bǔ)腎調(diào)肝中藥用于PCOS促排卵時(shí)可以達(dá)到促排卵的效果,其周期排卵率,每周期妊娠率及臨床妊娠率與枸櫞酸克羅米芬及來曲唑等經(jīng)典促排卵藥無顯著性差異；
　　 2.仙茅、巴戟天、菟絲子、淫羊藿、白芍藥及甘草等補(bǔ)腎調(diào)肝中藥用于PCOS患者促排卵時(shí)與枸櫞酸克羅米芬及來曲唑等

21、藥物相比具有以下優(yōu)勢(shì):單卵泡發(fā)育率高、對(duì)子宮內(nèi)膜影響小等；
　　 3.考慮到我們使用上述中藥促排卵時(shí)發(fā)現(xiàn)臨床妊娠結(jié)局并不優(yōu)于枸櫞酸克羅米芬及來曲唑等藥物,同時(shí)中藥使用的安全性等問題需要進(jìn)一步的研究去證實(shí),我們不推薦常規(guī)使用補(bǔ)腎調(diào)肝類中藥對(duì)PCOS患者進(jìn)行促排卵治療；
　　 4.對(duì)反復(fù)使用枸櫞酸克羅米芬、來曲唑等藥物治療失敗者,包括反復(fù)子宮內(nèi)膜過薄、多卵泡發(fā)育、藥物抵抗無反應(yīng)或藥物副作用無法耐受等患者可以考慮使用被證實(shí)有促

22、排卵作用的中藥,如:仙茅、巴戟天、菟絲子、淫羊藿、白芍藥及甘草等進(jìn)行促排卵治療。
　　 全文小結(jié)
　　 1.對(duì)5日齡雌性幼小鼠皮下注射丙酸睪丸酮成功造雄激素所致不孕(排卵障礙)小鼠模型；
　　 2.仙茅、巴戟天、菟絲子、淫羊藿、白芍藥及甘草等補(bǔ)腎調(diào)肝中藥對(duì)雄激素所致不孕小鼠具有促卵泡發(fā)育的作用；
　　 3.上述補(bǔ)腎調(diào)肝中藥顯著增加GDF-9因子在雄激素所致不孕小鼠中的表達(dá),這可能是菟絲子等6味中藥促卵泡發(fā)

23、育的機(jī)制之一；
　　 4.仙茅、巴戟天、菟絲子、淫羊藿、白芍藥及甘草用于多囊卵巢綜合征患者促排卵其排卵率及臨床妊娠率與克羅米芬或來曲唑相似,但hCG日內(nèi)膜厚度顯著高于其他兩組,同時(shí)中藥組能將異常升高PRL患者PRL濃度降至正常；
　　 5.由于缺乏對(duì)中藥使用安全性的研究,也無中藥促排卵優(yōu)于克羅米芬等促排要的證據(jù),我們不推薦使用上述中藥作為一線促排卵治療。但對(duì)反復(fù)使用枸櫞酸克羅米芬、來曲唑等藥物治療失敗者,或合并有高泌乳素