DDP-IV抑制劑對糖尿病大鼠左室心肌重塑與功能的影響及作用機(jī)制.pdf

1、研究背景:
　　 糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)病程緩慢，并發(fā)癥多且常累及心、腦、腎等全身重要臟器，糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)為常見、嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。DM糖脂代謝紊亂可導(dǎo)致心肌組織病理改變?yōu)樾募〖?xì)胞肥大、凋亡、壞死，間質(zhì)纖維化，炎癥等，表現(xiàn)為進(jìn)行性左心室結(jié)構(gòu)改變、功能異常，死亡率極高。DM治療現(xiàn)狀目前并不樂觀，仍存在諸多問題，單純降低血糖治療并不能完全降低心血管病

2、事件。因此，新型降糖藥物除具有保護(hù)胰島β細(xì)胞功能、降糖作用外，還應(yīng)具有保護(hù)靶器官、降低死亡率的作用，成為當(dāng)前基礎(chǔ)研究與臨床治療策略的重點。
　　 胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)是主要源于腸道末端L細(xì)胞分泌的腸促激素，受體在胰島、心肌、腦等組織內(nèi)廣泛表達(dá)，作用在機(jī)體攝入食物后，具有葡萄糖依賴性釋放、促進(jìn)餐后胰島素分泌等作用。2型DM患者體內(nèi)，GLP-1分泌水平或活性顯著下降，且內(nèi)源性GLP-1可被二肽基肽酶(DPP-Ⅳ)快速分解

3、。因此，DPP-Ⅳ抑制劑-西格列汀可使內(nèi)源GLP-1短期不被降解，具有升高GLP-1水平，增強(qiáng)并延遲胰島素釋放來降低血糖。晚近報道證實GLP-1可抑制缺血/再灌注損傷后的細(xì)胞凋亡。
　　 報道DPP-Ⅳ抑制劑可上調(diào)GLUT-4的表達(dá)，GLP-1受體興奮劑可降低2型DM患者高甘油三酯血癥、逆轉(zhuǎn)脂肪肝。DM心肌病變中Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積、排列紊亂，膠原降解酶(主要基質(zhì)金屬蛋白酶系統(tǒng)MMPs/TIMPs)表達(dá)異常，晚近報道，GLP-1受體

4、拮抗劑可抑制脂多糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞表達(dá)MMP-9，提示可能影響膠原酶的表達(dá)。心臟舒張功能不全病人外周血中DPP-Ⅳ活性與超聲參數(shù)E/E'比值呈正相關(guān)。GLP-1受體激動劑可抑制TGF-β1表達(dá)。尚未見DPP-Ⅳ抑制劑影響DM大鼠糖脂代謝、心肌脂質(zhì)含量以及心肌膠原網(wǎng)絡(luò)代謝的相關(guān)研究。
　　 心肌細(xì)胞凋亡、壞死廣泛存在于DM心肌組織中。DM心肌組織中TNF-α、IL-6表達(dá)增加，TNF-α與細(xì)胞膜TNFR1結(jié)合形成信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合物，可引發(fā)

5、細(xì)胞內(nèi)Bax、Bcl-2等基因異常表達(dá)，致細(xì)胞凋亡。受體相互作用蛋白家族(RIPs)是一類重要調(diào)節(jié)細(xì)胞死亡、存活的信號分子，其中RIP3具有自磷酸化、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與激活NF-kB的作用，是參與TNF-α介導(dǎo)的死亡受體凋亡通路的重要信號分子，且RIP3與線粒體能量代謝有關(guān)。DM心肌細(xì)胞凋亡中，RIP3是否參與其中，及DPP-Ⅳ抑制劑對DM心肌細(xì)胞凋亡、RIP3表達(dá)的影響以及兩者的相關(guān)性，目前尚未見相關(guān)報道。
　　 DPP-Ⅳ抑制劑

6、（西格列汀）通過抑制DPP-Ⅳ活性，提高GLP-1水平、發(fā)揮其生物學(xué)作用。因此，在既往研究基礎(chǔ)上，本部分從動物水平研究西格列汀對DM大鼠心肌組織的炎癥、膠原網(wǎng)絡(luò)代謝、脂質(zhì)含量及心肌細(xì)胞凋亡等病理改變的影響;對DM心肌組織中RIP3的表達(dá)及與凋亡的關(guān)系;并探討該藥對DM大鼠左心室功能的影響。通過本研究為DM的防治提供更多的方法。
　　 研究目的:
　　 1.探討DPP-Ⅳ抑制劑對DM心肌組織的炎癥反應(yīng)、膠原網(wǎng)絡(luò)代謝、脂質(zhì)含

7、量及心肌細(xì)胞凋亡等心肌重塑的影響;
　　 2.初步探討RIP3在DM心肌中的表達(dá)及DPP-Ⅳ抑制劑的干預(yù)作用;
　　 3.評價DPP-Ⅳ抑制劑對DM大鼠左心功能的影響。
　　 研究方法:
　　 1.DM大鼠模型的構(gòu)建、分組及藥物干預(yù)
　　 8周齡雄性Wistar大鼠70只，隨機(jī)分為四組:對照組(n=10只)[Control];糖尿病組(n=20只)[DM];糖尿病+DPP-Ⅳ抑制劑西格列汀組(低劑

8、量組，30mg/kg/d)(n=20只)[DPP-Ⅳi(Low)];糖尿病+DPP-Ⅳ抑制劑西格列汀組(高劑量組，50mg/kg/d)(n=20只)[DPP-Ⅳi(High)]。糖尿病各組高脂飼養(yǎng)4周(w)后，糖尿病各組大鼠腹腔注射小劑量STZ30mg/kg。2型糖尿病大鼠成模的診斷標(biāo)準(zhǔn)為:STZ注射后1周內(nèi)，連續(xù)2次空腹血糖≥11.1mmol/L，為糖尿病模型。模型穩(wěn)定后持續(xù)4w，給予對照組、DM組予以生理鹽水灌胃，DM藥物干預(yù)兩組分

9、別給予不同劑量DPP-Ⅳ抑制劑西格列汀研缽碾碎生理鹽水稀釋后灌胃，均再繼續(xù)喂養(yǎng)到實驗結(jié)束，處死稱取心臟重量，計算心臟重量/體重[HW/BW(mg/g)]比值后，留取標(biāo)本。
　　 2.各組大鼠基本指標(biāo)、糖脂代謝系列指標(biāo)及GLP-1水平的監(jiān)測
　　 實驗過程中除常規(guī)每2周測1次心率、體重、血壓與血糖外，期間，根據(jù)研究需要，各時間點為0、4、5、9、13、17、21w，抽取頸靜脈竇血1.5ml左右，分離血清，全自動生化分析儀測

10、定血總膽固醇、總甘油三酯、低密度脂蛋白膽固醇以及高密度脂蛋白膽固醇水平，以及免疫發(fā)光法測定糖化血紅蛋白，酶聯(lián)免疫法法測血清FFA、GLP-1水平，以及空腹血清胰島素水平，計算胰島素敏感指數(shù)。
　　 3.心電圖
　　 根據(jù)實驗不同時間點，描記肢體導(dǎo)聯(lián)(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、aVR、aVL、aVF)心電圖，觀察各組大鼠心臟電活動情況并記錄心電圖。
　　 4.超聲心動圖
　　 分別在0、13w、17w、21w不同時間點進(jìn)

11、行超聲心動圖檢查，測定指標(biāo)如下:左室收縮末內(nèi)徑(LVIDs)、左室舒張末內(nèi)徑(LVIDd)、射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、左室短軸縮短率(FS);二尖瓣口E波最大速度、A波最大速度、E/A;組織多普勒(TDI)二尖瓣環(huán)左室側(cè)壁測E'最大速度、A'最大速度，E'/A'，并計算E/E'。
　　 5.Millar導(dǎo)管測左心功能
　　 暴露左室心尖部后，利用10ml注射器針頭，內(nèi)有Milllar導(dǎo)管電極探頭直接行心尖穿刺精確控制插入左心

12、室，軟件分析心血管參數(shù)，左室收縮壓(LVSP)，左室舒張末壓(LVEDP)、左室內(nèi)壓最大上升速率(+dp/dt)、左室內(nèi)壓最大下降速率(-dp/dt)。記錄、導(dǎo)出有關(guān)數(shù)據(jù)、圖像資料，并計算左室松弛時間常數(shù)Tau=P/(-dp/dt)。
　　 6.心肌組織病理學(xué)檢測
　　 實驗結(jié)束處死動物后，進(jìn)行取材、固定、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片，常規(guī)HE染色、Masson染色及天狼星紅染色，觀察心肌組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)、膠原分布

13、情況等。油紅O染色用凍存心肌組織標(biāo)本。以3％戊二醛固定心肌組織后行透射電鏡觀察。并測心肌羥脯氨酸含量計算膠原含量。
　　 7.TUNEL染色
　　 石蠟切片行免疫組化法檢測凋亡細(xì)胞，顯微鏡下觀察、計數(shù)陽性染色細(xì)胞即凋亡細(xì)胞百分比數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 8.免疫組織化學(xué)染色
　　 取心肌組織石蠟切片，分別免疫組化檢測左室心肌組織炎性因子TNF-α、IL-6，膠原Ⅰ、Ⅲ與膠原降解酶MMP-1、9，以及RI

14、P3的表達(dá)，并進(jìn)行綜合分析。
　　 9.實時定量RT-PCR基因水平檢測
　　 取-80℃凍存的心肌組織，Trizol法提取心肌組織總RNA，實時定量RT-PCR技術(shù)檢測RIP3 mRNA的表達(dá)水平。
　　 10.Western blot檢測
　　 取-80℃保存的心肌組織，提取總蛋白，Western-Blot檢測左室心肌組織內(nèi)GLP-1含量及其受體表達(dá)，炎性因子TNF-a、IL-6，膠原Ⅰ、Ⅲ，部分膠原

15、降解酶MMP-1、9，以及RIP3的蛋白表達(dá)。
　　 11.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 所用數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。數(shù)值變量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間均數(shù)比較采用小樣本t檢驗，多組間均數(shù)比較采用One-Way ANOVA方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果:
　　 1.大鼠的一般情況
　　 糖尿病大鼠造模中，共4只未達(dá)標(biāo)準(zhǔn)予以剔除，整個實驗中共死亡8只，均為糖

16、尿病各組，最終58只大鼠最終完成實驗。其中，Control組10只;DM組15只; DM+ DPP-Ⅳi(Low)組16只;DM+DPP-Ⅳi（High）組17只。對照組精神狀態(tài)好，體重增加，反應(yīng)敏捷，毛色白而光澤。DM組出現(xiàn)多飲、多尿和消瘦癥狀，精神差，體重增加遲緩甚至下降，皮毛臟亂無光澤。藥物干預(yù)后的兩組，與DM組相比，一般情況均較好。實驗開始時，各組大鼠心率、體重和血壓均無差異（P＞0.05）。結(jié)束時，DM各組與對照組比較，體重下

17、降(P＜0.01-0.05)，心率、血壓升高(P＜0.01-0.05);藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，體重增加及心率、血壓不同程度下降(P＜0.01-0.05)。
　　 2.血液指標(biāo)檢測結(jié)果
　　 2.1各組糖脂代謝指標(biāo)的比較
　　 造模前、高脂飼養(yǎng)4周后，糖尿病各組存在胰島素抵抗?fàn)顟B(tài);造模后整個實驗過程中，DM組與對照組比較，F(xiàn)BG水平、上午10:00血糖水平及HbA1c，均顯著升高(P＜0.01);藥物干預(yù)后

18、的兩組與DM組比較，均不同程度下降(P＜0.01-0.05);造模成功后1周FINS無顯著差異，ISI顯著下降(P＜0.05);實驗?zāi)珼M組與對照組、兩藥物干預(yù)組比較，F(xiàn)INS顯著下降(P＜0.01-0.05);ISI在實驗第5-21周，DM組與對照組比較，顯著下降（P＜0.05）。
　　 糖尿病造模成功后整個實驗過程中，DM各組較對照組，血TC、TG、LDL-C、FFA水平均明顯升高(P＜0.01-0.05);藥物干預(yù)后的兩

19、組與DM組比較，均不同程度的降低(P＜0.01-0.05)。
　　 2.2檢測空腹、口服葡萄糖30min后GLP-1的血漿水平
　　 糖尿病造模成功并且模型穩(wěn)定后，于第8周開始給予藥物干預(yù)，DM與對照組比較，分別空腹、口服葡萄糖30min后GLP-1血漿水平均呈不同程度降低(P＜0.01-0.05);藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，在第13-21周，空腹、口服葡萄糖30min后，GLP-1血漿水平均有不同程度的升高(P＜0

20、.01-0.05)，尤其DM組給予高劑量DPP-Ⅳ抑制劑干預(yù)后，與對照組比較，無顯著性差異（P＞0.05）。
　　 3.心電圖的變化
　　 對照組ECG清晰可見P、QRS、T波，QRS波振幅一致。DM組10只心電圖異常表現(xiàn)，占66.67％，且QRS“電交替”現(xiàn)象多見，另可見室上速、室速、心動過緩等各種復(fù)雜心律失常;兩藥物干預(yù)組中，心電圖異常總計14只，占42.42％，未見復(fù)雜心律失常且“電交替”減少，提示DPP-Ⅳ抑制劑

21、可改善心臟電活動。
　　 4.超聲測量心臟結(jié)構(gòu)和功能指標(biāo)的變化
　　 左心結(jié)構(gòu)的改變:實驗開始時，各組之間左心腔室大小，LVIDs及LVIDd均無顯著性差異（P＞0.05）;實驗結(jié)束時，DM組與對照組比較，LVIDs及LVIDd均顯著擴(kuò)大(P＜0.05);藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，LVIDs及LVIDd均明顯減小(P＜0.05）。
　　 左室收縮功能的評價:實驗開始時，各組大鼠間FS和EF的變化均無顯著差異(

22、P＞0.05)。實驗結(jié)束時，DM組與對照組比較，F(xiàn)S、LVEF均不同程度降低(P＜0.01-0.05);藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，F(xiàn)S、LVEF均不同程度升高(P＜0.01-0.05)。
　　 左室舒張功能的評價:實驗開始時，各項指標(biāo)均無顯著差異(P＞0.05); DM組與對照組比較，第13w開始至21w實驗結(jié)束時，E/A、E'/A'比值不同程度降低(P＜0.01-0.05); E/E'比值不同程度升高(P＜0.01-0.0

23、5);藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，E/A、E'/A'比值不同程度升高(P＜0.01-0.05)，E/E'不同程度降低(P＜0.01-0.05)。
　　 5.Millar導(dǎo)管測量各組左室功能指標(biāo)的比較
　　 與對照組比較，DM組LVSP明顯下降(P＜0.01)、LVEDP升高(P＜0.01)、±dp/dt max絕對值降低(P＜0.01-0.05)及Tau絕對值延長(P＜0.01)。與DM組比較:LVSP在大劑量DPP-

24、Ⅳ抑制劑干預(yù)后明顯升高(P＜0.05)，在兩組DPP-Ⅳ抑制劑干預(yù)后，+dp/dt max(mmHg/s)均升高(P＜0.05)，LVEDP均顯著下降(P＜0.05)，-dp/dt max(mmHg/s)絕對值均升高(P＜0.05)，左室松弛時間常數(shù)(Tau)絕對值不同程度縮短(P＜0.01-0.05)，大劑量藥物干預(yù)組Tau縮短更顯著。
　　 6.DM大鼠左室心肌重塑及DPP-Ⅳ抑制劑的影響
　　 6.1大體標(biāo)本病理改

25、變及HE染色
　　 DM組與對照組比較，心臟標(biāo)本大體形態(tài)表現(xiàn)體積較大，HW/BW(mg/g)較大(P＜0.05);HE染色可見左室心腔擴(kuò)大、室壁肥厚;細(xì)胞橫截面積明顯增加(498.37±14.31 vs347.84±12.27 um3，P＜0.01);HE染色可見，心肌細(xì)胞肥大，可見肌纖維排列紊亂、斷裂現(xiàn)象，形態(tài)不規(guī)則，核大小不均。藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，心臟體積、HW/BW(mg/g)比值變小(P＜0.05）;左室心腔縮

26、小，肥厚減輕;心肌細(xì)胞橫截面積不同程度減少(P＜0.01-0.05); HE染色可見心肌細(xì)胞體積不同程度減小，細(xì)胞排列較規(guī)則、有序，核大小尚均一，高劑量藥物組則改善更明顯。
　　 6.2 DPP-Ⅳ抑制劑對DM心肌組織GLP-1含量、GLP-1R表達(dá)的影響
　　 實驗結(jié)束時，Western-Blot提示:與對照組比較，DM組心肌組織GLP-1含量顯著降低(P＜0.01)，GLP-1R表達(dá)也減少(P＜0.01）;藥物干預(yù)后

27、的兩組與DM組比較，心肌組織GLP-1含量、GLP-1R表達(dá)均不同程度升高(P＜0.01-0.05)，提示DPP-Ⅳ抑制劑干預(yù)后，心肌組織內(nèi)GLP-1含量升高，旦可提高GLP-1受體表達(dá)的密度。
　　 6.3 DPP-Ⅳ抑制劑減少DM心肌組織膠原的含量
　　 Masson染色所見:DM組與對照組大鼠比較，膠原纖維粗大，排列紊亂，分布不均，沉積增多;藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，沉積的心肌膠原減少，排列尚有序、分布也尚均勻

28、。
　　 天狼猩紅染色所見:DM組與對照組比較，心肌組織內(nèi)膠原纖維較明顯增加，排列紊亂，且可見不規(guī)則網(wǎng)狀膠原纖維圍繞在小動脈周圍;藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，可見心肌組織膠原沉積減少。
　　 膠原含量比較:與對照組比較，DM組左室心肌組織膠原含量(15.86±0.43 vs7.06±0.31 ug/mg，P＜0.01)、膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF％)(4.8±0.49 vs0.47±0.06，P＜0.01-0.05)以及血管

29、周圍膠原面積/管腔面積比（PVCA/LA）(2.74±0.37 vs0.5±0.02，P＜0.01-0.05)均不同程度升高。藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，左室心肌組織膠原含量均不同程度減少。
　　 免疫組化染色:DM組心肌組織與對照組比較，Ⅰ、Ⅲ型膠原陽性表達(dá)顯著增加;不同劑量DPP-Ⅳ抑制劑干預(yù)后，可見心肌組織棕色顆粒不同程度減少。
　　 Western-Blot: DM組與對照組比較，心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)顯

30、著升高(P＜0.01），藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，均可見心肌組織Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)不同程度降低（P＜0.01-0.05）。
　　 6.4 DPP-Ⅳ抑制劑對糖尿病大鼠心肌膠原酶MMP-1、9表達(dá)的影響
　　 免疫組化染色:DM組與對照組比較，MMP-1、9陽性表達(dá)顯著增加。不同劑量DPP-Ⅳ抑制劑干預(yù)后，心肌組織棕色顆粒不同程度減少。
　　 Western-Blot.DM組與對照組比較，心肌組織MMP-1、

31、9蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，心肌組織MMP-1、9表達(dá)均不同程度降低(P＜0.01-0.05)。
　　 6.5 DPP-Ⅳ抑制劑對糖尿病大鼠心肌組織炎性因子TNF-α、IL-6表達(dá)的影響
　　 免疫組化染色:對照組心肌細(xì)胞漿內(nèi)見少量、稀疏的淺棕色顆粒;DM組心肌細(xì)胞胞漿內(nèi)可見較多濃密深棕色顆粒。與DM組比較，不同劑量DPP-Ⅳ抑制劑干預(yù)后，可見心肌組織棕色顆粒分布散在、稀疏，有不同程

32、度減少。
　　 Western-Blot:DM組與對照組比較，心肌組織TNF-α、 IL-6蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01），藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，心肌組織TNF-α、IL-6蛋白表達(dá)均下降（P＜0.05）。
　　 6.6 DPP-Ⅳ抑制劑減少DM心臟脂質(zhì)的沉積
　　 油紅O染色結(jié)果，與對照組比較，DM組心肌脂肪含量(7.03±0.31 vs0.32±0.01，P＜0.01)、心外膜脂肪組織含量(12.7

33、6±0.48 vs0.47±0.03，P＜0.01)均顯著升高;藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，可見心肌組織脂肪含量、心外膜脂肪組織含量均呈不同程度減少(P＜0.01-0.05)。
　　 6.7糖尿病心肌組織RIP3的表達(dá)及DPP-Ⅳ抑制劑的干預(yù)
　　 免疫組化染色:DM組與對照組比較，RIP3棕黃色陽性顆粒表達(dá)增加，且分布在細(xì)胞核周圍較多，不同劑量DPP-Ⅳ抑制劑干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)棕黃色陽性顆粒表達(dá)不同程度減少。
　　

34、 實時定量RT-PCR、Western-Blot檢測:與對照組比較，DM組大鼠心肌組織RIP3 mRNA水平、蛋白水平表達(dá)均顯著增高(P＜0.01);藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，RIP3 mRNA水平、蛋白水平表達(dá)均不同程度降低(P＜0.01-0.05)。
　　 6.8透射電鏡觀察DPP-Ⅳ抑制劑對糖尿病心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 DM心肌細(xì)胞核形狀不規(guī)則，核固縮，染色質(zhì)聚集，呈現(xiàn)凋亡細(xì)胞的早期表現(xiàn);對照組心肌細(xì)胞

35、核仁清晰可見，核膜光滑、完整。藥物干預(yù)后的兩組，細(xì)胞核未見明顯染色質(zhì)聚集，無核固縮表現(xiàn)，核膜尚完整、光滑。
　　 6.9 TUNEL染色觀察DPP-Ⅳ抑制劑對糖尿病心肌組織細(xì)胞凋亡發(fā)生率的影響
　　 與對照組比較，DM組左室心肌組織凋亡細(xì)胞陽性率顯著增加(P＜0.01)，藥物干預(yù)后的兩組與DM組比較，細(xì)胞凋亡發(fā)生率顯著減少（P＜0.01）。
　　 6.10初步分析糖尿病心肌組織RIP3 mRNA表達(dá)與細(xì)胞凋亡率的

36、相關(guān)性
　　 結(jié)合糖尿病心肌組織RIP3 mRNA表達(dá)與糖尿病心肌組織細(xì)胞凋亡百分率，初步分析糖尿病大鼠心肌組織RIP3 mRNA表達(dá)與細(xì)胞凋亡百分率的相關(guān)性，得知Pearson相關(guān)系數(shù)r=0.795(P＜0.001)，可以初步判斷糖尿病大鼠心肌組織細(xì)胞凋亡百分率與RIP3 mRNA的表達(dá)呈顯著正相關(guān)。
　　 研究結(jié)論:
　　 1.DPP-Ⅳ抑制劑影響DM心肌組織炎癥反應(yīng)、膠原代謝、脂質(zhì)含量及心肌細(xì)胞凋亡的改變，