維胃方對胃潰瘍大鼠胃粘膜MPO-H+-K+-ATP酶活性影響的研究.pdf

1、課題依據(jù):
　　 胃潰瘍病(GU)是一種多病因疾病,亦是消化系統(tǒng)的常見疾病,呈世界性分布,約有5％-10％的人一生中患過此病。其發(fā)病機制較為復(fù)雜,目前認(rèn)為各種與發(fā)病有關(guān)的因素,如胃酸、胃蛋白酶、感染、遺傳、體質(zhì)、環(huán)境、飲食、生活習(xí)慣、神經(jīng)精神因素等,通過不同的途徑或機制,使胃粘膜攻擊因子和自身防御一修復(fù)因子之間失衡所致,其臨床特點為病程長,易復(fù)發(fā),且常伴一些嚴(yán)重的并發(fā)癥。
　　 目前治療消化性潰瘍的藥物主要為質(zhì)子泵抑制劑

2、(PPI)和H2受體拮抗劑(H2R),因這兩種藥物的使用,使胃潰瘍的愈合率顯著提高,但由于患者依從性、耐藥性、費用、副作用等問題的持續(xù)存在,致使該病的復(fù)發(fā)率仍居高不下。因此,研究胃潰瘍的理想治療方案仍是一項急迫而重要的任務(wù),近幾年來人們對于胃潰瘍治療藥物的開發(fā),往往從天然藥物上尋找突破口。
　　 中醫(yī)對該病有著悠久的理論研究歷史,積累了大量的臨床診治經(jīng)驗,尤其是金元時期以李東垣《脾胃論》為標(biāo)志而形成雛形的脾胃學(xué)說。導(dǎo)師勤求古訓(xùn)、

3、博采眾方,創(chuàng)制出了治療胃潰瘍的經(jīng)驗方——維胃方,其由茯苓、蒲公英、白及、三七組成,全方配伍攻補兼施、標(biāo)本兼治,通過臨床實踐證明其對潰瘍愈合及抗復(fù)發(fā)均有較為滿意的效果。本課題以中醫(yī)理論為指導(dǎo),以MPO、H+K+-ATP酶為切入點,參照Watanebet等的經(jīng)典造模方法并加以改進,建立乙酸誘導(dǎo)大鼠胃潰瘍模型,該模型的特點在于,其肉眼觀察和組織形態(tài)學(xué)觀察均與人類的消化性潰瘍非常相似,持續(xù)時間短則8-10天,長則半年,一般60天左右可以自然愈合

4、,自然復(fù)發(fā)率約為30％,并通過觀察胃大體標(biāo)本,進一步對造模處病理切片進行鏡下病理觀察,測定胃粘膜MPO、H+-K+-ATP酶活性,從而觀察并探討維胃方對大鼠實驗性胃潰瘍的治療機制。
　　 實驗方法:
　　 SPF級Wistar雄性大鼠56只,180～220g/只,隨機分為如下7組:正常組、模型組、自愈組、維胃方高劑量組、維胃方中劑量組、維胃方低劑量組、雷尼替丁組。正常組每日予正常飲食,模型組在造模3d后處死,自愈組觀察胃

5、潰瘍自愈情況,與用藥組同時處死。其余各用藥組均在造模3d后予相應(yīng)藥物2ml/d灌胃,給藥7d后處死。除正常組外,余各組大鼠造模前禁食不禁水24h,予10％水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉后,于劍突下縱向逐層切開腹壁約2em,拉出胃體,并在胃前壁竇體交界處靠胃竇側(cè)漿膜面,用浸泡過100％乙酸的直徑5mm濾紙片壓貼60s,然后將胃體送回體內(nèi),逐層縫合腹壁,最后用75％酒精消毒手術(shù)切口。采集標(biāo)本前大鼠禁食不禁水24h,具體步驟如下:①稱重,10％水合氯

6、醛腹腔內(nèi)注射麻醉后備皮,固定；②取出鼠胃,置于冰面上,沿胃大彎剪開鼠胃,展平,沖洗胃內(nèi)壁,觀察胃粘膜大體標(biāo)本；③取部分潰瘍處腺胃組織放入10％甲醛溶液中固定12～16h(4℃),進一步石蠟包埋,制作病理切片；④在冰面上用玻片將新鮮腺胃部胃粘膜組織及粘液輕輕刮下,-80℃低溫冷凍后用萬分之一天平準(zhǔn)確稱重,與冰生理鹽水按1:9的比例按常法制備成10％組織勻漿,10000r/min低溫離心10min,取上清液儲于-20℃冰箱中備用,分別用于測

7、定總蛋白、MPO、H+-K+-ATP酶活性。
　　 統(tǒng)計學(xué)處理:
　　 實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x)±s)表示。多樣本均數(shù)比較用單因素方差(One-Way ANOVA)分析,組間均數(shù)兩兩比較,若方差齊性,用LSD法,若方差不齊,則用Dunnett's T3法,檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。所有數(shù)據(jù)均用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計。
　　 主要結(jié)果:
　　 1、胃粘膜大體標(biāo)本觀察正常組大鼠胃粘膜光整完好,無充血

8、、水腫、糜爛等；模型組大鼠漿膜層充血水腫,表面可見少量淡咖啡色物質(zhì),胃粘膜充血、水腫、糜爛,多處可見出血點和潰瘍；自愈組大鼠漿膜層充血、水腫、粘連,胃粘膜表面充血、糜爛,潰瘍愈合不全；維胃方中劑量組大鼠胃粘膜表面光滑,輕度淤血；維胃方高、低劑量組大鼠胃粘膜存在出血點或較小潰瘍,淤血較為明顯；雷尼替丁組大鼠胃粘膜表面輕度淤血,未見潰瘍,偶見充血或糜爛點。
　　 2、病理切片鏡下觀察正常組大鼠胃粘膜層光整完好,腺體排列整齊,未見炎細(xì)

9、胞浸潤及粘膜下出血傾向；模型組粘膜層變薄,部分潰瘍深及肌層,粘膜下層毛細(xì)血管內(nèi)可見明顯的血流瘀滯,大量炎性細(xì)胞浸潤,平滑肌細(xì)胞排列紊亂或出現(xiàn)斷裂；自愈組大鼠胃粘膜缺損達腺細(xì)胞層或粘膜下層,腺細(xì)胞排列紊亂,粘膜下層毛細(xì)血管內(nèi)可見明顯血流瘀滯,有炎細(xì)胞浸潤,肌細(xì)胞部分?jǐn)嗔?；維胃方中劑量組大鼠胃粘膜偶見斷裂,上皮細(xì)胞腫脹,腺體間隙擴大,但粘膜下層微循環(huán)無明顯病理改變；維胃方高、低劑量組部分潰瘍?nèi)睋p達粘膜下層,腺細(xì)胞密度不勻,粘膜下層炎細(xì)胞浸潤

10、；雷尼替丁組偶見缺損達腺細(xì)胞層,腺體結(jié)構(gòu)良好,肌層細(xì)胞排列紊亂,未見明顯潰瘍病變。
　　 3、MPO活性變化方差齊,F=77.085,P=0.000,差異有顯著性意義,可認(rèn)為各組胃粘膜MPO活性存在差別,造模后模型組大鼠胃粘膜MPO活性與正常組相比顯著升高(P=0.000),自愈組與模型組相比無顯著差異(P=0.409)。經(jīng)維胃方及雷尼替丁治療的組別,胃粘膜MPO活性均較自愈組顯著降低(維胃方高中低劑量各組、雷尼替丁組與自愈組相

11、比,P值分別為:0.000、0.000、0.048、0.001),其中以維胃方中劑量組降低最為顯著(平均值為:1.739±0.268),但維胃方高、中劑量不呈劑量依賴關(guān)系,中劑量組反而低于高劑量組。雷尼替丁組與維胃方高、低劑量組比較無顯著性差異(P值分別為0.111、0.125),與中劑量組比較則有顯著性差異(P=0.000),且高于中劑量組。
　　 4、H+-K+-ATP酶活性變化方差齊,F=22.891,P=0.000,差異

12、有顯著性意義,可認(rèn)為各組胃粘膜H+-K+-ATP酶活性存在差別,模型組的H+-K+-ATP酶活性顯著低于正常組及自愈組(P值分別為0.000、0.000),而經(jīng)藥物治療后,各治療組H+-K+-ATP酶活性均接近正常組(維胃方高中低劑量各組、雷尼替丁組與正常組相比,P值分別為:0.081、0.053、0.316、0.136),且高于自愈組(維胃方高中低劑量各組、雷尼替丁組與自愈組相比,P值分別為:0.025、0.040、0.000、0.0

13、13)。
　　 結(jié)論:
　　 1、動物實驗是研究疾病發(fā)生機理和尋找藥物作用機制的重要手段,乙酸造模法是直接以乙酸燒灼胃漿膜面形成潰瘍,其表現(xiàn)和潰瘍愈合速度與人類消化性潰瘍極為相似,適合用于藥物療效的觀察研究,且造模穩(wěn)定性高,方法簡單,可操作性強,是目前普遍認(rèn)可與使用的方法。
　　 2、根據(jù)胃大體標(biāo)本的觀察情況,造模成功率高達100％,自愈組大鼠胃潰瘍的自愈效果差,用藥組起到一定治療作用,并以維胃方中劑量組的療效為

14、最佳。用藥各組潰瘍愈合情況與自愈組相比有明顯區(qū)別,尤其是維胃方中劑量組及雷尼替丁組,愈合效果均優(yōu)于其他組別。
　　 3、從鏡下病理切片觀察情況來看,維胃方中劑量組更接近正常組,腺體形態(tài)基本完好,炎性細(xì)胞少,粘膜下微循環(huán)未見明顯病理狀態(tài),恢復(fù)情況較好,證明其治療胃潰瘍的部分機制是通過改善微循環(huán)、抗炎和細(xì)胞再生。模型組胃粘膜破壞較嚴(yán)重,缺損偶及肌層,造模處腺體完全破壞,非造模處炎性細(xì)胞浸潤嚴(yán)重,腺體變形,粘膜下微循環(huán)病理改變明顯。<

15、br>　　 4、在對維胃方各組的治療效果觀察中,其表現(xiàn)出了復(fù)雜的量效關(guān)系,說明在藥材、煎煮等均相同的條件下,中藥的劑量對療效影響極為重要。
　　 5、對大鼠胃粘膜MPO活性的測定結(jié)果反映出:維胃方對胃潰瘍的治療效果是明顯的,數(shù)據(jù)中各治療組活性均較自愈組及模型組低(維胃方高中低劑量各組、雷尼替丁組與模型組比較,P值分別為:0.000、0.000、0.006、0.000,與自愈組比較,P值分別為:0.000、0.000、0.048

16、、0.001),維胃方高、低劑量組活性與雷尼替丁組相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P值分別為0.111、0.125),但中劑量組活性低于雷尼替丁組(P=0.000),表明其抗炎作用優(yōu)于雷尼替丁。
　　 6、從H+-K+-ATP酶活性變化的數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果可以看出:潰瘍程度越嚴(yán)重,胃泌酸功能越差,其活性越低(模型組與正常組比較P=0.000),而經(jīng)維胃方治療后,各組的活性均接近正常組(維胃方高、中、低劑量組與正常組比較,P值分別為:0.081、0.

17、053、0.316),與雷尼替丁組的值亦很接近,說明維胃方有明顯修復(fù)胃粘膜潰瘍的作用,其可能機理并非在于抑制基礎(chǔ)胃酸分泌,相反,它能修復(fù)受損的胃粘膜,使其泌酸功能恢復(fù)正常,其效果與臨床常用胃潰瘍治療藥物雷尼替丁相似,這也符合大體標(biāo)本的觀察結(jié)果。
　　 綜上所述,本研究的實驗造模是成功的,通過對大鼠胃潰瘍大體愈合情況及潰瘍處粘膜病理組織切片光學(xué)顯微鏡下觀察,發(fā)現(xiàn)維胃方能通過改善微循環(huán)、抗炎和細(xì)胞再生有效治療胃潰瘍,并以其臨床標(biāo)準(zhǔn)劑