生物降解聚乳酸-乙醇酸-己內酯載環(huán)丙沙星的合成，表征及體外、體內抗菌活性的研究.pdf

1、前言:
　　骨髓炎是感染性微生物引起的骨的炎癥，是由于微生物感染并導致骨骼破壞的炎癥反應過程。慢性骨髓炎的治療包括手術清除失活，感染組織，骨穩(wěn)定性重建，消滅死腔，良好的軟組織覆蓋，骨重建，并聯(lián)合應用抗生素。長期全身應用抗生素副作用大，難以在病灶局部形成高的抗生素濃度。而局部應用藥物可以彌補以上缺點。
　　目前臨床批準的聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥鏈珠載藥局部應用治療骨髓炎雖取得一定的成功，但其仍存在藥物釋放不完全，易致細菌耐藥，需

2、二次取出等缺點。作為改進，人們在科研中應用可吸收生物材料替代骨水泥鏈珠治療動物慢性骨髓炎取得了良好的效果。
　　聚乳酸乙醇酸酯是最為常用的聚酯類生物可吸收材料，是良好的局部抗生素載體。但其質硬，可產生大量酸性降解產物。本研究試圖在聚乳酸乙醇酸酯中引入丙交酯單體，合成一種酸性降解產物更少，具有彈性的新的三元共聚物，并對其理化性質，載藥后體內體外抗菌效果做進一步評價。
　　目的:
　　1.合成PLGC(PLA-GA-CL)

3、三元共聚物，并對其理化性質進行表征。
　　2.以PLGC載環(huán)丙沙星形成復合物，進行體外藥物釋放研究，抗菌效果研究。
　　3.構建大鼠慢性骨髓炎模型，進行PLGC復合物的體內抗菌實驗研究。
　　研究方法:
　　1.三元共聚物PLGC的合成:PLGC通過DLLA、GA與CL的的本體開環(huán)聚合反應制備而得。所有共聚反應均在130±2℃下進行24h，制成棒狀以進行力學實驗。
　　2.三元共聚物的體外水解及酶解:將PL

4、GC裁成長為40mm的植入劑，精密稱重后將植入劑置于20 mL pH=7.4的PBS溶液中，并置于37℃空氣浴中，每天振蕩8h，振幅為65次/分，PBS溶液每周更換一次。分別在第1、2、3、4、5、6、7周取出樣品，干燥，稱重。聚合物降解前后介質的pH通過配備三合一微量電極的pH計進行測試。
　　3.力學性能分析:采用拉力實驗機對聚合物的力學性能進行測試，測試標準參照國標GB/T1040.1-2006，夾頭速度50mm/min。每

5、種樣品平行操作5個樣品，結果為平均值。
　　4.PLGC復合物的制作:精確稱量5g PLGC三元共聚物，并將其溶解在氯仿中，然后按照藥物與載體材料的重量比為1∶10加入環(huán)丙沙星藥物0.5g，攪拌均勻后，澆鑄在培養(yǎng)皿中，待氯仿完全揮發(fā)后揭下藥膜，干燥至恒重。
　　5.PLGC復合物的體外釋放藥物檢測:取載藥顆粒100mg為一組，共3組作為3個平行樣品，以空白載體材料PLGC作為空白對照，分別用10mL蒸餾水浸泡，置于（37±1

6、）℃恒溫空氣浴中振搖，每24h更換一次蒸餾水，在波長271nm處測定釋放液的吸收度A，由標準曲線方程計算藥物濃度按回歸方程計算釋藥量。
　　6.PLGC復合物釋放藥物后電鏡檢測:復合物在未置入生理鹽水前，與置入生理鹽水30日時的樣品干燥后進行電鏡掃描觀察形態(tài)。
　　7.PLGC復合物的細胞毒性檢測:大鼠骨髓間充質干細胞購買自廣州賽業(yè)公司，MTT方法檢測BMSCs對PLGC復合物材料浸提液的濃度梯度依賴性。利用不同濃度的浸提液

7、處理細胞，檢測MTT的OD值，反映細胞活性。
　　8.PLGC復合物體外釋放藥物的抗菌活性測定:金黃色葡萄球菌ATCC25923購自上海北諾生物科技有限公司，活化后的金黃色葡萄球菌轉接到營養(yǎng)肉湯中，37℃培養(yǎng)24h后，獲得108CFU/ml的菌液，用無菌棉拭子蘸取已制備好的金黃色葡萄球菌菌液，均勻涂抹于營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基上。在營養(yǎng)瓊脂平板上無菌打孔，加入2小時，15日，30日緩沖液100μl進行抑菌環(huán)檢測。恒溫培養(yǎng)24h。讀取抑菌

8、環(huán)大小。
　　9.Wistar大鼠脛骨慢性骨髓炎模型的建立與處理:實驗中所有的手術步驟都經中國醫(yī)科大學動物倫理委員會批準，嚴格按步驟執(zhí)行。10％水合氯醛麻醉后，無菌條件下，顯露脛骨近端1/3，以1.0mm直徑的電鉆鉆入脛骨骨髓腔，生理鹽水沖洗后以50μl的魚肝油酸鈉注射液注射進入髓腔內，隨后以無菌生理鹽水配置的金黃色葡萄球菌菌液50μl注射進入髓腔內，再以骨蠟封閉骨髓腔入口。術后4周，3只大鼠處死后行x-ray檢查，3只大鼠處死后

9、行HE染色檢查。余18只大鼠隨機分為實驗組，對照組，空白組，行二次手術清創(chuàng)，實驗組骨髓腔內植入PLGC復合物，對照組脛骨骨髓腔內植入PLGC，空白組無植入物。每周測量大鼠體重，WBC計數變化至4周，4周時處死大鼠，行病灶處微生物學檢查，測量其內細菌含量。
　　10.采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件包對所得實驗數據進行統(tǒng)計分析，計量資料以(x)±S表示，實驗組間的對比分析采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果:

10、r>　　1.在所述聚合條件下，所得共聚物具有較高的產率(＞90％)。
　　2.當CL含量為的20mol％和40mol％時，PLGC三元共聚物降解7周后的失重率分別為89.08％和76.74％，而PLGA幾乎降解完全。當CL含量為的20mol％和40mol％時，PLGC三元共聚物降解3周后PH值由7.4下降至分別為6.92，7.11，而PLGA值下降至6.46。
　　3.當CL含量由0 mol％增加至40mol％時，PLGC三

11、元共聚物的彈性模量及拉伸強度分別由3136 MPa，51.63 MPa降低至3.7 MPa，1.38 MPa。同時，共聚物由堅硬材料轉變?yōu)橄鹉z態(tài)材料。
　　4.載藥過程屬于物理混合過程，對PLGC三元共聚物的性能無影響。
　　5.PLGC復合物可持續(xù)，足量釋放藥物至少33天。
　　6.初始樣品表面平整且分散藥物顆粒，30天后，釋藥后的載藥復樣品較容易脆裂，載藥樣品表面及內部出現了大小不一的凹坑和孔洞。
　　7.各

12、個實驗組與對照組之間結果SPSS統(tǒng)計之后無統(tǒng)計學差異。證明PLGC復合物沒有細胞毒性，具有良好的生物相容性。
　　8.PLGC復合物在2小時時釋放的環(huán)丙沙星溶液抗金黃色葡萄球菌的抑菌環(huán)大小為34.0±0mm，4小時，15天，30天時釋放的環(huán)丙沙星溶液產生的抑菌環(huán)大小分別為18.33±1.25mm,13.33±2.33mm，26.0±0mm，所釋放的藥物在檢驗的時間點均具有抗菌活性。
　　9.x-ray及HE染色結果均證實，在

13、骨髓炎模型建造4周后大鼠脛骨內形成了明確的慢性骨髓炎，二次行清創(chuàng)術后，將PLGC復合物植入實驗組大鼠體內，治療4周后實驗組大鼠體重回升，WBC明顯降，與對照組及空白組差異均有統(tǒng)計學意義。微生物學檢測結果顯示，實驗組大鼠病灶內細菌含量明顯減低，與對照組及空白組差異均有統(tǒng)計學意義。
　　結論:
　　PLGC聚合物有著與PLGA相似的特征，可以替代PLGA作為藥物載體。但其有低酸性的特點，可降低病灶局部的炎性反應，也是對PH值敏感