番茄SI-FIL1轉(zhuǎn)錄激活域EPR1的鑒定及其磷酸化對轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的影響研究.pdf

1、乙烯是一種重要的植物激素，在植物的生長發(fā)育過程中起著重要調(diào)控作用。植物在種子萌發(fā)、側(cè)根發(fā)育、莖生長、果實(shí)發(fā)育成熟、器官的衰老脫落等生命活動(dòng)中存在著各種乙烯應(yīng)答反應(yīng)。研究表明，植物中有幾百個(gè)基因受到乙烯的調(diào)控。對擬南芥以及番茄乙烯突變體的大量研究表明，乙烯應(yīng)答反應(yīng)存在明顯的時(shí)空特異性，相同的乙烯濃度在植物不同的組織或不同的發(fā)育階段會引起完全不同的乙烯應(yīng)答反應(yīng)。
　　 EIN3/EILs(Ethylene-Insensitive3，

2、EIN3；EIN3-Like，EIL)蛋白家族是乙烯信號通路中一個(gè)重要的正調(diào)控因子。EIN3/EILs存在于細(xì)胞核，作為一種轉(zhuǎn)錄因子能與乙烯應(yīng)答基因啟動(dòng)子的特異序列結(jié)合，并激活基因的轉(zhuǎn)錄。EIN3/EILs蛋白能直接調(diào)控ERF(Ethylene Response Factor)基因家族的轉(zhuǎn)錄，研究者推測EIN3/EILs蛋白家族通過調(diào)控不同的ERF基因從而引起各類具有時(shí)空特異性的乙烯應(yīng)答反應(yīng)。然而，EIN3/EILs是一個(gè)較小的蛋白家族

3、，已知在擬南芥中存在四種EIN3/EILs蛋白，在番茄中也僅存在四種EIN3/EILs蛋白。研究表明EIN3/EILs蛋白存在功能冗余，并且EIN3/EILs基因的轉(zhuǎn)錄并不受乙烯調(diào)控。那么，EIN3/EILs蛋白家族是如何響應(yīng)乙烯信號并調(diào)控下游數(shù)量龐大的乙烯應(yīng)答基因而最終引起多樣化的乙烯應(yīng)答反應(yīng)呢?對此目前尚無任何報(bào)道。因此，深入研究EIN3/EILs蛋白家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理將有助于闡明乙烯應(yīng)答反應(yīng)調(diào)控過程。研究結(jié)果具有重要的理論意義。<

4、br>　　 磷酸化修飾對轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)節(jié)作用已得到廣泛的認(rèn)同。在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)番茄S1-EIL1蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能受到磷酸化的調(diào)控。本研究中，在Sl-EIL1中分析鑒定了EPR1磷酸化功能域，并通過瞬時(shí)表達(dá)熒光檢測、BiFC(Bimolecular fluorescence complementation)以及轉(zhuǎn)基因分析等技術(shù)對EPR1功能進(jìn)行了深入研究，分析了EPR1磷酸化在Sl-EIL1轉(zhuǎn)錄調(diào)控過程中的作用機(jī)理，并初

5、步建立了EIN3/EILs蛋白起始轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式。主要研究結(jié)果與結(jié)論如下：
　　 (1)EPR1功能域的預(yù)測與分析。采用Group-based Prediction system(GPS2.1)軟件預(yù)測分析了EIN3/EILs蛋白家族高度保守區(qū)域內(nèi)的磷酸化位點(diǎn)，結(jié)合ExASy在線PROSITE分析軟件，對所預(yù)測的8個(gè)保守磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行進(jìn)一步的分析鑒定。推測在EIN3/EILs蛋白的DNA結(jié)合功能域的N端存在一個(gè)谷氨酰胺富集區(qū)(Q-

6、richdomain)，并具有一個(gè)高度保守的PKA磷酸化位點(diǎn)，該區(qū)域具有明顯的轉(zhuǎn)錄激活功能域特點(diǎn)，我們將它命名為EIN3/EILs-phosphorylation region1(EPR1)。
　　 (2)EPR1功能域?qū)L-EIL1轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能的影響。對Sl-EIL1的EPR1堿基位點(diǎn)進(jìn)行PCR位點(diǎn)突變，獲得突變基因Sl-EM1和Sl-EM2(Sl-EIL1-mutant1 andSl-EIL1-mutant2)。采用原生質(zhì)

7、體轉(zhuǎn)化瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因分析等方法，對Sl-EIL1、Sl-EM1和Sl-EM2的功能進(jìn)行分析比較，確認(rèn)EPR1功能域?qū)l-EIL1的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能有著密切的影響。
　　 (3)EPR1功能域作用機(jī)理的研究。采用BiFC技術(shù)分析比較了Sl-EIL1、Sl-EM1和Sl-EM2的二聚化及異聚化活性，發(fā)現(xiàn)EPR1功能域?qū)l-EIL1的二聚化活性有著重要的影響，因此推測EPR1功能域通過調(diào)控Sl-EIL-1的二聚化從而影響SL-