多途徑制備類β細胞及其應用的基礎(chǔ)研究.pdf

1、糖尿病已經(jīng)成為僅次于惡性腫瘤的對人類健康危害極大的慢性疾病，傳統(tǒng)的藥物治療并不能改變糖尿病的進程，胰腺移植和胰島移植給糖尿病的治愈帶來了曙光，然而供體細胞來源不足和移植物免疫排斥問題阻礙了其進一步推廣，尋找新的移植源細胞顯得非常重要。骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)因具有取材方便、來源豐富、具有巨大的多向分化潛能、易于被外源性基因轉(zhuǎn)染等特點，使其成為理想的種子細胞，因此以自體分離出BMSCs為種子細胞，在體外培養(yǎng)，大量擴增以達到足夠量的細

2、胞，通過組織工程改造制備出類β細胞，再自體移植到糖尿病個體體內(nèi)，或?qū)⒊蔀橛行У慕鉀Q供體缺乏和免疫排斥的新途徑。
　　 本研究分離出小鼠的BMSCs，在體外擴增培養(yǎng)，通過多細胞因子誘導法、共培養(yǎng)誘導法、轉(zhuǎn)胰島素基因和轉(zhuǎn)PDX-1、NeuroD1和MafA基因等四種途徑將BMSCs制備成類β細胞，比較四種途徑的特點，并移植到糖尿病小鼠模型不同的器官，選出最佳的移植部位，進一步將大型實驗動物畢格犬的BMSCs制備成類β細胞，借助肝臟介

3、入技術(shù)將其自體移植到糖尿病畢格犬體內(nèi)，觀察其長期療效和生物安全性。整個研究分為四個部分。
　　 第一部分骨髓間充質(zhì)干細胞誘導為類β細胞的研究
　　 目的：誘導法將BMSCs制備成類β細胞；
　　 方法：通過體外分離、培養(yǎng)小鼠的骨髓間充質(zhì)干細胞，獲取大量的種子細胞，運用細胞因子誘導劑誘導和共培養(yǎng)誘導，將骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化為類β細胞，并觀察它的體外生物學特性；
　　 結(jié)果：兩種方法均能誘導出類β細胞，均

4、有胰島素分泌，細胞因子誘導法誘導出類β細胞對葡萄糖刺激胰島素分泌有反應，但兩種方法制備出的類β細胞產(chǎn)量均較低；
　　 結(jié)論：多細胞因子誘導法誘導BMSCs制備的類β細胞在功能上更加接近β細胞。
　　 第二部分骨髓間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)基因制備類β細胞的研究
　　 目的：轉(zhuǎn)基因法將BMSCs制備成類β細胞；
　　 方法：通過逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將外源性胰島素基因轉(zhuǎn)入小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，使其表達外源性胰島素基因，獲得分泌

5、胰島素的類β細胞；通過腺病毒載體將PDX-1、NeuroD1及MafA基因轉(zhuǎn)導入小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，刺激內(nèi)源性的胰島素基因的表達，獲得類β細胞，比較兩種途徑制備類β細胞的效果；
　　 結(jié)果：轉(zhuǎn)胰島素基因制備的類β細胞能夠分泌胰島素，制備效率高，但對葡萄糖刺激無反應，轉(zhuǎn)PDX-1、NeuroD1及MafA基因制備的類β細胞既能分泌胰島素也能對葡萄糖刺激產(chǎn)生反應，但制備效率較低；
　　 結(jié)論：兩種轉(zhuǎn)基因法均能制備出類β細胞

6、，但轉(zhuǎn)胰島素基因法制備的類β細胞的功能有待進一步提高，轉(zhuǎn)三基因法制備出的類β細胞在功能上與β細胞更加接近，但需提高制備效率。
　　 第三部分類β細胞移植部位選擇及在體內(nèi)分布的研究
　　 目的：研究類β細胞移植的最佳部位及其在體內(nèi)分布情況；
　　 方法：將前部分實驗獲得轉(zhuǎn)胰島素基因的類β細胞分別移植入糖尿病小鼠模型的肝臟、腎臟、胰腺、脾臟及尾靜脈。移植后監(jiān)測對比各組糖尿病鼠的血糖、體重、IPGTT、胰島素水平，并對

7、移植受體器官進行組織切片和免疫組化分析，選擇出最佳移植部位，并通過尾靜脈移植GFP小鼠MSCs，觀察其在糖尿病模型體內(nèi)的分布情況；
　　 結(jié)果：肝臟移植組血糖下降、體重增加、IPGTT、血清胰島素水平均優(yōu)于其它器官移植組，尾靜脈移植后，細胞向胰腺等器官分布；
　　 結(jié)論：肝臟是進行類β細胞體內(nèi)移植的理想部位，MSCs移植到糖尿病小鼠體內(nèi)，有向著胰腺等器官歸巢分布的趨勢。
　　 第四部分自體肝內(nèi)移植類β細胞對Bea

8、gle犬糖尿病長期療效及安全性研究
　　 目的：研究類β細胞自體肝內(nèi)移植對糖尿病Beagle犬的長期療效及安全性；
　　 方法：通過構(gòu)建pMSCV-Ins-EGFP雙表達重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，轉(zhuǎn)染Beagle犬BMSCs，制備類β細胞，運用肝動脈介入技術(shù)，將類β細胞自體移植入糖尿病畢格犬肝內(nèi)，通過監(jiān)測比較糖尿病Beagle犬移植前后各項生理指標，評價其是否具有長期穩(wěn)定的治療效果，同時進行肝臟生理功能及病理組織形態(tài)學檢測，并