兒童急性白血病γ-谷氨酰水解酶DNA甲基化和microRNA調(diào)控研究.pdf

1、目的：甲氨喋呤（MTX）是急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）患兒鞏固期重要的化療藥物，γ-谷氨酰水解酶（GGH）是細(xì)胞內(nèi)MTX代謝的關(guān)鍵酶。GGH活性受基因多態(tài)性、染色體核型和表觀遺傳學(xué)等因素影響，目前有關(guān)GGH基因多態(tài)性和染色體核型的研究已較深入，而表觀遺傳學(xué)尤其是 DNA甲基化和 microRNA（miRNA）調(diào)控的研究卻罕見報(bào)道。本研究擬探討 ALL和急性髓細(xì)胞白血病（AML）細(xì)胞中GGH基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲基化改變與GGH mRN

2、A表達(dá)的關(guān)系，分析CpG島甲基化改變與MTX臨床毒副作用的相關(guān)性，并對(duì)miRNA對(duì)GGH mRNA表達(dá)的影響進(jìn)行初步研究。
　　方法：收集68例非超二倍體B-ALL、29例AML骨髓樣本作為研究對(duì)象，另收集10例免疫性血小板減少性紫癜（ITP）骨髓標(biāo)本，40例健康兒童外周血樣本作為對(duì)照，分別提取骨髓或外周血基因組DNA、總RNA、miRNA。采用甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析（MS-HRM）結(jié)合重亞硫酸鹽PCR測序法（BSP）對(duì)

3、GGH基因啟動(dòng)子區(qū)兩個(gè)CpG島（CpG1和CpG2）進(jìn)行甲基化檢測分析，熒光定量PCR測定GGH mRNA及miR-26b-5p的水平，HRM方法篩查GGH基因3′端非編碼區(qū)（3’UTR）的單核苷酸多態(tài)性（SNP)。按世界衛(wèi)生組織化療毒副作用分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)收集ALL患兒MTX毒副作用臨床資料，統(tǒng)計(jì)分析GGH不同CpG島甲基化改變和MTX毒副作用的相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　(1) ALL和AML兒童白血病細(xì)胞的CpG1島甲基化發(fā)生率

4、分別為30.9％（21/68）和20.7%（6/29），對(duì)照組未檢出CpG1島甲基化。ALL和AML兒童白血病細(xì)胞的CpG2島甲基化發(fā)生率分別為44.1%（30/68）和37.9%（11/29），遠(yuǎn)高于對(duì)照組的6.0%（3/50）(Fisher確切概率法：P=0.000)。
　　(2) CpG1島甲基化或CpG2島超甲基化（甲基化水平大于10%）可明顯降低ALL和AML兒童白血病細(xì)胞中GGH mRNA表達(dá)（ALL-CpG1:t=4

5、.632, P=0.000;ALL-CpG2:t=3.250, P=0.006;AML-CpG1:t=-2.254, P=0.037;AML-CpG2:t=1.328, P=0.202），2個(gè)CpG島均發(fā)生甲基化時(shí)影響最大。
　　(3)對(duì)照組外周血白細(xì)胞中的miR-26b-5p與GGH mRNA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，外周血白細(xì)胞miR-26b-5p表達(dá)水平高于各組骨髓細(xì)胞，與GGH mRNA在兩組標(biāo)本中表達(dá)相反，提示miR-26b-5p可

6、能對(duì)GGH mRNA的表達(dá)發(fā)揮下調(diào)作用；GGH不同CpG島甲基化改變和MTX毒副作用未發(fā)現(xiàn)有意義的關(guān)聯(lián)。
　　(4)首次在中國健康兒童和白血病患兒中確定 GGH基因3′UTR的SNP1385T>C(rs17279558)的等位基因頻率，分別是10.3%和11.0%，兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未發(fā)現(xiàn)其調(diào)節(jié)功能。
　　結(jié)論：
　　(1)研究證實(shí)兒童白血病中GGH基因啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化現(xiàn)象常見， CpG1島甲基化為白血病細(xì)

7、胞所特有，CpG2島甲基化頻率明顯高于正常兒童。
　　(2) CpG1島甲基化和CpG2島超甲基化可顯著降低GGH表達(dá)水平，2個(gè)CpG島均發(fā)生甲基化時(shí)影響最大，GGH啟動(dòng)子區(qū)CpG甲基化可一定程度影響GGH表達(dá)。
　　(3)正常兒童中發(fā)現(xiàn)miR-26b-5p水平和GGH表達(dá)水平存在負(fù)相關(guān)，提示miR-26b-5p水平可能對(duì)GGH表達(dá)發(fā)揮下調(diào)作用。
　　(4)在中國白血病患兒和健康兒童中首次鑒定GGH基因3′UTR下游的