基于真菌漆酶作用機制的結(jié)構(gòu)改造及改性漆酶降解有機磷毒物的研究.pdf

1、目的:
　　1、通過研究真菌漆酶復(fù)合物中酶與配體的相互作用，進一步揭示其催化氧化機制。
　　2、基于降解實驗數(shù)據(jù)探索真菌漆酶降解有機磷毒物的規(guī)律和作用機制。
　　3、改造漆酶并預(yù)測改性漆酶降解有機磷毒物的效果，通過實驗制備理論預(yù)測效果好的改性漆酶。
　　方法:
　　1、從5個已知的真菌漆酶復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)出發(fā)，利用分子模擬技術(shù)和能量優(yōu)化方法，研究其在晶體結(jié)構(gòu)和非晶體狀態(tài)下酶與配體的相互作用，在分子水平進一步

2、揭示其催化氧化機制。
　　2、基于文獻報道的降解實驗研究總結(jié)反應(yīng)規(guī)律，并利用分子模擬技術(shù)和分子對接方法探索真菌漆酶降解有機磷毒物的機制。
　　3、在漆酶作用機制研究的基礎(chǔ)上，提出漆酶的分子改造策略，利用同源建模方法構(gòu)建不同點突變漆酶的空間結(jié)構(gòu)模型。
　　4、利用分子模擬技術(shù)和分子對接方法，理論預(yù)測改性漆酶降解有機磷毒物的效果。
　　5、利用酵母表達系統(tǒng)制備理論預(yù)測效果好的改性漆酶。
　　結(jié)果:
　　1

3、、在1KYA中與底物發(fā)生疏水作用的氨基酸殘基主要有Phe162、Leu164、Phe265、Pro391和Gly392，在2HRG中的主要有Val162、Phe331、Pro390和Gly391，在3FU7、3FU8和3FU9中的主要有Ala191、Pro192、Phe371、Phe427、Leu429。此外，底物結(jié)合到漆酶活性口袋后，其結(jié)構(gòu)中富含電子的基團貼近其中保守的組氨酸，并且?guī)缀蹩偸桥c之形成氫鍵。
　　2、真菌漆酶與介質(zhì)組

4、成的漆酶介質(zhì)體系可以有效降解一類具有Ⅴ類神經(jīng)毒劑結(jié)構(gòu)特征的有機磷毒物，其中漆酶總是白腐菌漆酶，而介質(zhì)是影響催化效率的重要因素。有機磷毒物中處在連接硫原子的β位碳原子上的氮原子具有十分重要的地位，它很可能在反應(yīng)中首先失去電子。在中性溶劑中，它可能被氧化生成N-氧化物，這在水溶液中是穩(wěn)定的，但當(dāng)存在有機溶劑時則會發(fā)生競爭性的分解反應(yīng)。
　　3、本研究利用MOE-Dock模塊提供的分子對接功能探索真菌漆酶與底物對接的優(yōu)化條件發(fā)現(xiàn):將分別

5、在Amber99力場和MMFF94x力場中進行加氫處理的酶和底物繼續(xù)在MMFF94x力場中進行對接、放置函數(shù)選用Triangle Matcher、打分函數(shù)選用London dG、優(yōu)化函數(shù)選用Forcefield、結(jié)果評估依據(jù)結(jié)合自由能，可以較好展現(xiàn)真菌漆酶與底物的相互作用。
　　4、真菌漆酶催化氧化一類具有Ⅴ類神經(jīng)毒劑結(jié)構(gòu)特征的有機磷毒物時，底物與酶活性口袋中的Phe162、Pro391、G1y392、Ala393等多個氨基酸殘基

6、發(fā)生疏水作用，底物的氮端貼近其中保守的組氨酸，底物的磷端處于活性口袋外側(cè)，并與Gly392形成氫鍵。
　　5、為了提升漆酶直接催化降解較難處理的有毒有害物的能力，本研究通過分析認為改造漆酶活性口袋中的氨基酸、增強兩者間的結(jié)合親和力是有效的改造策略。變色栓菌漆酶的來源和應(yīng)用十分廣泛，而且其降解有機磷毒物的實驗也取得了很好的效果，是很有潛力的改造對象。
　　6、本研究利用MOE-Homology Model模塊提供的同源建模功能

7、構(gòu)建1KYA突變結(jié)構(gòu)的模型，建模試驗結(jié)果表明:設(shè)置模型打分函數(shù)為GB/Ⅵ、力場函數(shù)為Amber99，在建模完成后優(yōu)化處在高能角的氨基酸，可以構(gòu)建較為可靠的突變漆酶結(jié)構(gòu)模型。
　　7、本研究分別構(gòu)建了變色栓菌漆酶的F162A突變、D206A突變、F265A突變、F332A突變、P391A突變、P391L突變和F162A/F332A突變的結(jié)構(gòu)模型。分析所建模型的拉氏圖發(fā)現(xiàn)，高能角占該酶氨基酸總數(shù)的比例不超過0.6％而且均處在酶活性部位

8、外。除D206A突變和P391L突變外，突變漆酶的活性口袋均變大了，其中F265A突變、F332A突變和F162A/F332A突變顯著擴大了底物入口。
　　8、變色栓菌漆酶在發(fā)生F265A突變、F332A突變、P391A突變和P391L后與VX的結(jié)合自由能降低了，而在發(fā)生F162A突變、D206A突變和F162A/F332A突變后該參數(shù)升高了，其中變化最大的是P391A突變（大約降低了10％）。
　　9、改性漆酶與VX的結(jié)合

9、模式和未突變時相比并未發(fā)生顯著改變，底物與酶活性口袋中的Phe162、Pro391、Gly392、Ala393等多個氨基酸殘基發(fā)生疏水作用，底物的氮端貼近其中保守的組氨酸，底物的磷端處于活性口袋外側(cè)，可能與Gly392形成氫鍵。
　　10、變色栓菌漆酶在發(fā)生F162A突變、F332A突變、P391A突變和F162A/F332A突變后，活性口袋中組氨酸的NE2原子與VX中氮原子之間的距離大大減少了，從6.67(A)分別降至4.63(

10、A)、4.56(A)和4.45(A)和4.51(A)。
　　11、利用畢赤酵母GS115表達系統(tǒng)制備了含P391A突變變色栓菌漆酶的溶液4ml，實驗其濃度為0.24mg/ml。
　　結(jié)論:
　　1、疏水作用是影響漆酶底物和氧化產(chǎn)物交替與酶結(jié)合或釋放的重要影響因素。當(dāng)?shù)孜锝Y(jié)合到漆酶活性口袋后，其結(jié)構(gòu)中富含電子的基團幾乎總是與活性口袋中保守的組氨酸形成氫鍵，這可能會提高電子從底物傳遞到漆酶T1Cu的效率，進而提高漆酶的催化

11、效率。
　　2、真菌漆酶與一類具有Ⅴ類神經(jīng)毒劑結(jié)構(gòu)特征的有機磷毒物發(fā)生相互作用時，底物與酶活性口袋中的Phe162、Pro391、Gly392、Ala393等多個氨基酸殘基發(fā)生疏水作用，這是兩者間的主要結(jié)合力;底物的氮端嵌入到活性口袋中，貼近其中的組氨酸，這可能會提高電子傳遞的效率;底物的磷端處于活性口袋外側(cè)，與Gly392形成氫鍵。
　　3、本研究分別構(gòu)建了變色栓菌漆酶的F162A突變、D206A突變、F265A突變、F3