ABCB11基因突變與原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石發(fā)病機(jī)制的相關(guān)性研究.pdf

1、目的：
　　ABCB11基因編碼的蛋白質(zhì)(bile salt export pump，BSEP)的功能主要是膽汁轉(zhuǎn)運(yùn)，而其基因突變與膽汁淤積及膽石癥發(fā)病密切相關(guān)。前期研究中也表明ABCB11基因在原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者中存在基因突變，并且影響到編碼蛋白的表達(dá)。因此，本研究目的重點(diǎn)是深入探討ABCB11基因突變與原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石發(fā)病的聯(lián)系，以及研究ABCB11基因突變影響其編碼蛋白BSEP在細(xì)胞定位、表達(dá)的機(jī)制。
　　方法：

2、
　　1.收集收治的原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者443例（入院以后均經(jīng)術(shù)前影像學(xué)檢查明確診斷），同時(shí)收集我院健康體檢中心健康人群560例為對照組（均排除慢性肝病及膽石癥）。收集上述PIS患者和健康人群的外周血液5ml，立即分離淋巴細(xì)胞，放-80℃冰箱保存。收集統(tǒng)計(jì)原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者相關(guān)臨床資料。
　　2.提取淋巴細(xì)胞DNA，并通過對ABCB11基因全外顯子測序，檢測病例組（原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者）與對照組（健康人群）ABCB1

3、1基因突變，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析ABCB11基因突變與臨床資料間的關(guān)聯(lián)。
　　3.對原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者的新鮮冰凍肝組織提取總mRNA與膜蛋白，并采用定量PCR技術(shù)與western blot技術(shù)檢測原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者ABCB11基因的mRNA與BSEP的表達(dá)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析與ABCB11基因突變的相關(guān)性。
　　4.構(gòu)建包含人的ABCB11基因全部開放閱讀框的野生型質(zhì)粒，通過定點(diǎn)突變再構(gòu)建突變型質(zhì)粒。HEK293細(xì)

4、胞分別轉(zhuǎn)染野生型和突變型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后提取總mRNA與膜蛋白，并運(yùn)用定量PCR技術(shù)與western blot技術(shù)檢測突變型與野生型質(zhì)粒的mRNA與BSEP的表達(dá)。轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染野生型和突變型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行免疫染色，采用激光共聚焦顯微鏡掃描技術(shù)觀察BSEP在MDCK細(xì)胞的分布。
　　結(jié)果：
　　1.原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者與健康人群相比ABCB11基因存在兩個(gè)有意義的突變位點(diǎn)，分別是錯(cuò)義突變r(jià)s1181

5、09635(p=0.025)與同義突變r(jià)s497692(p=0.006)，并且這兩個(gè)突變位點(diǎn)與術(shù)前黃疸具有密切相關(guān)性(p=0.026，p=0.011)。
　　2.發(fā)生錯(cuò)義突變r(jià)s118109635的原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者肝組織BSEP表達(dá)降低，mRNA表達(dá)水平無變化，而發(fā)生同義突變r(jià)s497692的原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者肝組織mRNA與BSEP表達(dá)都降低。
　　3.在細(xì)胞水平我們也發(fā)現(xiàn)突變r(jià)s118109635(A865V)

6、使BSEP在HEK293細(xì)胞膜上表達(dá)降低，在MDCK細(xì)胞膜上分布減少，而mRNA表達(dá)水平無變化。
　　結(jié)論：
　　ABCB11基因突變（rs118109635和rs497692）與原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石存在密切聯(lián)系，并且與術(shù)前黃疸具有密切相關(guān)性。同時(shí)，具有rs118109635或rs497692突變的原發(fā)性肝內(nèi)膽管結(jié)石患者肝組織BSEP的表達(dá)均明顯降低。此外，體外實(shí)驗(yàn)也表明突變r(jià)s118109635使BSEP在細(xì)胞膜上表達(dá)以及分