甲基蓮心堿對糖尿病血管內(nèi)皮細(xì)胞和交感神經(jīng)節(jié)損傷的作用及機(jī)理研究.pdf

1、背景：糖尿病是危害人類健康的四大疾病之一，目前我國是世界上糖尿病發(fā)病人數(shù)最多的國家。糖尿病嚴(yán)重影響著人民健康和社會發(fā)展，對糖尿病的防治已成為醫(yī)學(xué)科學(xué)工作者的一個重要課題。糖尿病的主要危害不是糖尿病本身，而是在糖尿病發(fā)展過程中出現(xiàn)的各種慢性并發(fā)癥。糖尿病引發(fā)的交感神經(jīng)和心血管損傷并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，是致殘、致死的重要原因。血管內(nèi)皮細(xì)胞是具有血管調(diào)節(jié)功能和分泌作用的重要器官。頸上交感神經(jīng)節(jié)的節(jié)后神經(jīng)纖維可分布至心神經(jīng)叢，影響心臟和

2、血管的活動。研究報道蓮籽芯具有降血糖作用。甲基蓮心堿(neferine，Nef)是從睡蓮科植物蓮成熟種子的綠色胚芽(蓮籽芯)中提取的一種雙芐基異喹啉類生物堿。本實(shí)驗(yàn)研究探索甲基蓮心堿在糖尿病及其并發(fā)交感神經(jīng)和心血管損傷中的作用及其可能作用的新靶點(diǎn)，并為糖尿病及其并發(fā)癥的防治提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 目的：⑴通過觀察高糖致血管內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)變化及甲基蓮心堿的影響，了解甲基蓮心堿對高糖致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及可能機(jī)理；⑵幾乎

3、全部與人類疾病有關(guān)的基因與大鼠基因有同源性。實(shí)驗(yàn)觀察甲基蓮心堿對2型糖尿病模型大鼠血糖、血脂、血胰島素及血壓影響的同時，了解甲基蓮心堿對糖尿病模型大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)CCL5及CCR5表達(dá)的影響，探討糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制及甲基蓮心堿的作用機(jī)理；⑶應(yīng)用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法觀察糖尿病模型大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)相關(guān)蛋白質(zhì)分子的變化，篩選藥效作用靶點(diǎn)，揭示甲基蓮心堿防治糖尿病并發(fā)癥的作用機(jī)理，為臨床推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法：①以

4、高濃度(44mM)的葡萄糖作用于原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)共孵育5天誘導(dǎo)模擬糖尿病內(nèi)皮細(xì)胞損傷。應(yīng)用硝酸還原酶法檢測細(xì)胞上清液中一氧化氮(NO)的含量；熒光法測定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平；美國Superarray RT2 ProfilerTM PCR基因表達(dá)譜芯片進(jìn)行多基因分析；通過免疫組織化學(xué)、原位雜交、RT-PCR和蛋白印跡分析從內(nèi)皮細(xì)胞基因表達(dá)譜中篩選出的和糖尿病并發(fā)癥有重要相關(guān)性的趨化因子5(CCL5)及其受體C

5、CR5 mRNA和蛋白表達(dá)變化，并觀察甲基蓮心堿對其影響。②選用雄性SD大鼠，通過高糖高脂飲食加腹腔小劑量注射鏈脈佐菌素復(fù)制糖尿病大鼠模型，運(yùn)用生化、放免、血壓測定、雙向電泳、免疫組織化學(xué)、原位雜交、RT-PCR和蛋白印跡等檢測手段和方法，觀察甲基蓮心堿對糖尿病大鼠體重、空腹血糖、血脂、血胰島素、血壓及頸上神經(jīng)節(jié)和心肌組織CCL5及其受體CCR5 mRNA和蛋白表達(dá)的影響。③通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選出糖尿病大鼠模型頸上交感神經(jīng)節(jié)相關(guān)蛋

6、白質(zhì)的變化并觀察甲基蓮心堿的作用，并將其中與糖尿病并發(fā)癥有重要相關(guān)性的二甲基精氨酸氨基水解酶1(DDAH1)和泛素羧端水解酶L1(UCHL1)蛋白進(jìn)一步應(yīng)用蛋白印跡方法檢測，確定甲基蓮心堿對神經(jīng)節(jié)DDAH1和UCHL1表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：⑴高糖孵育HUVEC細(xì)胞5天后，細(xì)胞培養(yǎng)上清液中NO含量顯著性減少，細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高；高糖同時使用甲基蓮心堿能顯著性增加高糖所致NO含量的減少，降低高糖所致ROS水平的升高。PCR

7、芯片結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性高糖處理后有16個基因上調(diào)，10個基因下調(diào)，其中變化最大的是與內(nèi)皮細(xì)胞活性和內(nèi)皮細(xì)胞損傷有關(guān)的CCL5。RT-PCR證實(shí)高糖培養(yǎng)細(xì)胞CCL5和CCR5mRNA增加，甲基蓮心堿能糾正高糖引起的CCL5和CCR5 mRNA的表達(dá)上調(diào)。蛋白印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)慢性高糖引起CCL5和CCR5蛋白表達(dá)上調(diào)，甲基蓮心堿能顯著降低高糖所致的CCL5和CCR5蛋白表達(dá)的上調(diào)。⑵甲基蓮心堿處理后使2型糖尿病模型大鼠體重增加，血壓降低，心率減慢，空

8、腹血糖、血胰島素、總膽固醇、甘油三酯降低，高密度脂蛋白升高，即甲基蓮心堿具有較好的改善糖尿病大鼠胰島素抵抗和調(diào)整脂代謝紊亂作用。RT-PCR和原位雜交結(jié)果顯示糖尿病大鼠頸上神經(jīng)節(jié)和心肌組織中CCL5和CCR5 mRNA的表達(dá)上調(diào)，甲基蓮心堿能降低CCL5和CCR5 mRNA的表達(dá)上調(diào)。免疫組織化學(xué)和蛋白印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠頸上神經(jīng)節(jié)和心肌組織中CCL5和CCR5蛋白的表達(dá)增加，甲基蓮心堿可降低CCL5和CCR5蛋白的增加表達(dá)。⑶差異蛋

9、白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分離、鑒定糖尿病大鼠頸上神經(jīng)節(jié)差異蛋白結(jié)果顯示：差異表達(dá)的23個蛋白質(zhì)斑點(diǎn)經(jīng)鑒定后，歸為17種蛋白，這17種蛋白按功能分為細(xì)胞骨架、能量代謝、信號傳導(dǎo)、NO生成調(diào)節(jié)、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)六大類。糖尿病模型大鼠頸上交感神經(jīng)節(jié)大部分蛋白表達(dá)量均不同程度下調(diào)，只有NADH脫氫酶表達(dá)量上調(diào)。甲基蓮心堿能糾正糖尿病大鼠大部分改變的蛋白表達(dá)量。二維電泳及蛋白印跡檢測結(jié)果證實(shí)糖尿病大鼠頸上神經(jīng)節(jié)和心肌組織DDAH1和UCHL1表達(dá)降低。DD