乙酸乙酯抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性急性肝衰竭及其作用機(jī)制的研究.pdf

1、本研究目的在于探討乙酸乙酯對(duì)D-氨基半乳糖/細(xì)菌脂多糖(GalN/LPS)誘導(dǎo)的小鼠實(shí)驗(yàn)性小鼠急性肝衰竭的保護(hù)作用，并使用LPS激活的RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞深入探討其作用機(jī)制。
　　 建立小鼠急性肝衰竭模型，給受試?yán)ッ?KM)小鼠皮下注射(sc)生理鹽水、溶劑或乙酸乙酯（0.4 g/kg-l.0g/kg），30min后腹腔注射(iv) GalN/LPS(800mg/100μg)·kg-l連續(xù)觀察48h，記錄動(dòng)物死亡情況。同

2、樣處理的另一組動(dòng)物在腹腔注射GalN/LPS之后不同時(shí)間點(diǎn)th、2h、4h、8h、12h分別采集血清和肝臟樣本。測(cè)定血清中ALT、NO;肝臟樣本中NO;肝臟樣本行標(biāo)準(zhǔn)HE染色，觀察形態(tài)學(xué)變化。
　　 使用RAW264.7小鼠巨噬細(xì)胞建立細(xì)胞模型。使用不同劑量乙酸乙酯(100μmol/mL，125μmol/mL，150μmol/mL，175μmol/mL，200μmol/mL)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理(30min)后，用LPS(800ng

3、/mL)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激。在不同時(shí)間點(diǎn)采集樣本，使用Elisa法檢測(cè)乙酸乙酯抑制LPS誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生TNF-、IL-ip、IL-6的狀況，使用化學(xué)比色法檢測(cè)iNOS的活性，以及使用Griess試劑法檢測(cè)NO的濃度，同時(shí)檢測(cè)相關(guān)炎性因子（TNF-、IL-1β、IL-6、COX-2、iNOS和IL-10）mRNA表達(dá)量的變化，以及抑制NFκB P65蛋白活化的情況。并且為驗(yàn)證乙酸乙酯與RAW264.7細(xì)胞的結(jié)合速率以及乙酸乙酯作用時(shí)間與作用效果

4、的關(guān)系，而設(shè)定短時(shí)干預(yù)方案：預(yù)處理20min后，吸除剩余液體后，加入LPS進(jìn)行刺激，在不同時(shí)間點(diǎn)采集樣本，測(cè)定樣本中的NO、TNF-，IL-1β，IL-6。
　　 小鼠經(jīng)乙酸乙酯預(yù)處理30min，可以顯著降低GalN/LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肝衰竭造成的死亡率，與模型組比較24h死亡率從90.3％降低到19.0％。同時(shí)，乙酸乙酯預(yù)處理8h、12h時(shí)分別可以顯著降低小鼠血液及肝臟中NO的含量。在以谷丙轉(zhuǎn)氨酶和肝切片為指標(biāo)評(píng)估肝損傷的結(jié)

5、果中，經(jīng)乙酸乙酯預(yù)處理的小鼠，其損傷程度顯著低于模型組。在肝切片中經(jīng)乙酸乙酯預(yù)處理的組織，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組織形態(tài)明顯優(yōu)于模型組。
　　 在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，乙酸乙酯預(yù)處理可以顯著抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-、IL-1β、IL-6、iNOS和NO的生成，并且在一定濃度范圍內(nèi)，其抑制效率與乙酸乙酯濃度成正比。使用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)乙酸乙酯175μmol/mL預(yù)處理下，TNF-、IL-1β、IL-6、iNOS和COX-2mRNA表達(dá)被顯著抑

6、制。免疫組化染色結(jié)果顯示，乙酸乙酯預(yù)處理可以抑制NFKB由胞質(zhì)向胞核的轉(zhuǎn)移。短時(shí)處理結(jié)果顯示，乙酸乙酯短時(shí)處理(20min)仍可顯著抑制TNF-、IL-1β、IL-6和NO的產(chǎn)生。
　　 乙酸乙酯對(duì)GalN/LPS誘導(dǎo)小鼠的急性肝衰竭有顯著的抑制作用。其機(jī)制可能是抑制NFKB的活化，上調(diào)促炎因子，如TNF-、IL-1、IL-6等基因的表達(dá)、下調(diào)炎癥抑制因子如IL-10基因的表達(dá)，從而抑制促炎因子的生成。乙酸乙酯能顯著抑制LPS誘