結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞內(nèi)結(jié)核抗原檢測(cè)的應(yīng)用研究.pdf

1、目的：結(jié)核性腦膜炎(Tuberculous meningitis，TBM)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，約占結(jié)核病的7～10％，是以腦膜、大腦實(shí)質(zhì)受損為主，并可波及脊髓、脊膜的非化膿性炎癥。TBM臨床癥狀復(fù)雜、不典型，早期影像學(xué)檢查無(wú)特異性改變，而賴以診斷顱內(nèi)感染的腦脊液生化、細(xì)胞學(xué)檢查結(jié)果往往與其它類(lèi)型顱內(nèi)感染有所重疊，并不能簡(jiǎn)單借以鑒別感染類(lèi)型。MTB是

2、胞內(nèi)寄生菌，機(jī)體受到MTB感染后，其首先被單核巨噬細(xì)胞吞噬，故使用免疫學(xué)方法檢測(cè)腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞內(nèi)的結(jié)核桿菌特異性抗原或許可作為T(mén)BM診斷的較為簡(jiǎn)捷、敏感、并且特異性高的診斷方法。ESAT-6即6kDa早期分泌性抗原靶，是從MTB短期培養(yǎng)濾液中分離純化出的一種低分子量分泌性蛋白，在早期感染的單核細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)時(shí)，ESAT-6蛋白表達(dá)即明顯提高，因此推測(cè)檢測(cè)單核細(xì)胞內(nèi)ESAT-6具有更好的敏感性。本實(shí)驗(yàn)第一部分選擇結(jié)核分枝桿菌早期分泌抗原ESA

3、T-6與PPD為檢測(cè)對(duì)象，采用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)染色的方法觀察單核細(xì)胞的染色情況，判斷結(jié)核抗原的存在，而第二部分在以上基礎(chǔ)上通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡技術(shù)(Laser scanning confocalmicroscope，LSCM)對(duì)部分TBM及對(duì)照組患者外周血及腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞內(nèi)的ESAT-6進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)細(xì)胞做分層掃描，進(jìn)行三維重建和ESAT-6相對(duì)熒光強(qiáng)度值測(cè)定而達(dá)到對(duì)細(xì)胞內(nèi)結(jié)核抗原的定性、定量、定位及動(dòng)態(tài)變化分析，進(jìn)一步探尋TBM

4、的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：所有病例均來(lái)自寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、寧夏結(jié)核病醫(yī)院2009年12月～2012年2月臨床診斷為結(jié)核性腦膜炎的住院患者，共60例。其中男性32例，女性28例；發(fā)病年齡16歲～76歲，中位值年齡28.5歲；選用Thwaites等提出的TBM臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)作為納入標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)所有患者均進(jìn)行腦脊液常規(guī)、生化、細(xì)胞學(xué)檢查(MGG染色)和阿利新蘭染色。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法標(biāo)記外周血及腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞內(nèi)的PPD、ESAT-6

5、抗原。采用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，部分涂片經(jīng)LSCM觀察并測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度。
　　結(jié)果：TBM組抗結(jié)核藥物治療前腦脊液標(biāo)本MGG染色呈混合細(xì)胞學(xué)反應(yīng)，淋巴細(xì)胞及激活淋巴細(xì)胞比例占主導(dǎo)；抗結(jié)核藥物治療15d腦脊液中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)略有減少，激活淋巴細(xì)胞比例明顯增加；抗結(jié)核藥物治療30d腦脊液標(biāo)本MGG染色呈淋巴細(xì)胞為主的混合細(xì)胞學(xué)反應(yīng)，中性粒細(xì)胞老化，激活淋巴細(xì)胞仍較多，并可見(jiàn)激活的單核細(xì)胞。PPD、ESAT-6熒光免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測(cè)結(jié)果

6、示：TBM組外周血(PB)及腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞中PPD的陽(yáng)性檢出率分別為63.3％(38/60)和83.33％(50/60)；對(duì)照組PB及腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞中PPD的陽(yáng)性檢出率分別是6.45％(4/62)和4.84％(3/62)。
　　TBM組PB及腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞中ESAT-6的陽(yáng)性檢出率分別為53.33％(32/60)和76.67％(46/60)；對(duì)照組PB及腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞中ESAT-6陽(yáng)性檢出率均為3.23％(2/62)。PPD和ES

7、AT-6在TBM患者中的檢出率均明顯高于非TBM患者。兩組相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。ESAT-6較之PPD有著更好的特異性。
　　對(duì)20例ESAT-6陽(yáng)性的TBM患者及20例ESAT-6陰性的對(duì)照組患者PB及腦脊液細(xì)胞涂片進(jìn)行免疫熒光雙標(biāo)記后在LSCM下觀察，結(jié)果見(jiàn)TBM組ESAT-6均勻分布于單核細(xì)胞胞漿和胞膜。陽(yáng)性單核細(xì)胞體積略大，呈圓形或卵圓形。胞漿較松散，呈綠色熒光，而對(duì)照組陰性染色細(xì)胞則結(jié)合的熒光很少，普遍熒光強(qiáng)度極弱，所有

8、胞核均呈藍(lán)色。經(jīng)檢測(cè)，TBM組PB及腦脊液?jiǎn)魏思?xì)胞ESAT-6平均熒光值分別為(22.45±13.35；26.55±11.34)，與對(duì)照組(2.45±0.89；2.22±0.37)相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。對(duì)20例TBM患者于治療3周后再次進(jìn)行如上檢測(cè)，結(jié)果治療后的ESAT-6平均熒光值明顯降低，治療前后比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論：(1)初步建立了利用免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)TBM單核細(xì)胞內(nèi)抗原的方法。(2)ESAT-