缺血后處理對(duì)腦缺血再灌注大鼠TLR4-TRIF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響.pdf

1、目的：缺血后處理（ischemic post-conditioning, IPO）能夠激發(fā)機(jī)體內(nèi)源性保護(hù)作用，減輕缺血再灌注（ischemia reperfusion, I/R）后的炎癥反應(yīng)，但具體作用機(jī)制目前尚不明確。本課題旨在探討 IPO對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠 Toll樣受體4（Toll-like receptor4, TLR4）- Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域接頭分子（Toll-interleukin1 receptor dom

2、ain-containing adapter-inducing interferon-b, TRIF）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的影響，進(jìn)一步闡述IPO的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，為臨床應(yīng)用IPO治療缺血性卒中提供理論依據(jù)。
　　方法：研究選用130只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠并隨機(jī)分為假手術(shù)組（sham組）30只，模型組和干預(yù)組各50只，sham組根據(jù)手術(shù)后，模型組和干預(yù)組根據(jù)再灌注后時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)分為6h、12h、24h、48h和72h5

3、個(gè)亞組，sham組每個(gè)亞組各6只，模型組和干預(yù)組每個(gè)亞組各10只。后兩組采用Zea-longa線栓法建立大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型。sham組僅手術(shù)暴露頸總動(dòng)脈及分叉處，不阻斷大腦中動(dòng)脈。在再灌注開始時(shí)即模型建立后2h對(duì)干預(yù)組大鼠進(jìn)行IPO處理（即術(shù)后2 h將栓線拔出至頭部位于頸總動(dòng)脈分叉處，10s后再將栓線置入初始位置10s，如此重復(fù)6次）。對(duì)模型組大鼠僅拔出

4、栓線，不給予IPO處理。于再灌注后6h、12h、24h、48h、72h等時(shí)間點(diǎn)，采用Menzies法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分；2,3,5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, TTC）染色觀察腦梗死體積；原位末端標(biāo)記法（terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）法檢測(cè)缺血側(cè)腦組織細(xì)胞凋

5、亡；實(shí)時(shí)定量熒光 PCR（Real-time quantitative PCR, qPCR）檢測(cè)大鼠缺血側(cè)顳、頂葉皮質(zhì)TLT4-TRIF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的特異性結(jié)構(gòu)分子及關(guān)鍵細(xì)胞因子 TLR4、TRIF、TRIF相關(guān)的接頭分子(TRIF-related adaptor molecule，TRAM)、干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor3, IRF-3)及β干擾素（interferon-β, INF-β）

6、等的mRNA表達(dá)；免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）檢測(cè)大鼠缺血側(cè)腦組織中TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β等結(jié)構(gòu)分子及關(guān)鍵細(xì)胞因子蛋白陽性細(xì)胞的分布與表達(dá)；免疫印跡法(western blotting)定量檢測(cè)大鼠缺血側(cè)顳、頂葉皮質(zhì)中TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β等結(jié)構(gòu)分子及關(guān)鍵細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：模型組、干預(yù)組大鼠都出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損及缺血側(cè)大腦

7、半球梗死。相比模型組，干預(yù)組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分得到顯著改善（t=2.963～5.262，P＜0.05），腦梗死體積明顯減少（t=3.341～3.875，P＜0.05），凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯減少（t=2.332～3.643，P＜0.05）。模型組和干預(yù)組TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-βmRNA和蛋白表達(dá)于再灌注6h時(shí)已顯著升高。qPCR結(jié)果顯示干預(yù)組TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及 IFN-β mRNA表達(dá)較模

8、型組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)顯著降低（t=2.240～6.587，P＜0.05），免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β蛋白陽性細(xì)胞主要位于缺血側(cè)額、顳葉皮質(zhì)，干預(yù)組陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)較模型組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)顯著降低（t=2.256～8.180，P＜0.05）。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示干預(yù)組 TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β蛋白表達(dá)較模型組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)顯著降低（t=2.943～8.