M3受體、MLCK及p-MLC在1型糖尿病小鼠膀胱組織中的表達及意義.pdf

1、目的：糖尿?。╠iabetes mellitus,DM）是由多種病因所引起的以慢性血糖升高為主要表現(xiàn)的代謝性疾病，是由于胰島素分泌不足和（或）其作用缺陷引起的。糖尿病隨著病程的進展會出現(xiàn)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)等多系統(tǒng)慢性進行性病變。糖尿病泌尿系統(tǒng)發(fā)癥中最常見的是糖尿病膀胱功能障礙（DBD）。
　　糖尿病膀胱功能障礙（DBD）目前是指一組臨床癥候群，主要包括儲尿期及排尿期功能障礙，臨床表現(xiàn)有膀胱過度活動（OAB）、膀胱感覺減

2、退、排尿后膀胱殘余尿量增加和逼尿肌收縮力下降。因其發(fā)病機制較為復(fù)雜，尚未被完全闡明，故該病診治目前仍比較困難。毒蕈堿型受體M3受體與乙酰膽堿（ACh）結(jié)合后會直接引起平滑肌細胞興奮收縮。肌球蛋白輕鏈激酶（myosin light chain kinase,MLCK），是調(diào)節(jié)平滑肌細胞收縮的關(guān)鍵蛋白。目前普遍認為，副交感神經(jīng)釋放的乙酰膽堿與膀胱平滑肌細胞上M3受體結(jié)合后使胞漿內(nèi)游離鈣濃度迅速升高。升高的鈣離子與胞漿中無活性鈣調(diào)蛋白（cal

3、modulin,CaM）結(jié)合后成為具有活性的Ca2+-CaM復(fù)合體并使細胞內(nèi)MLCK激活，被激活的MLCK使肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化（即p- MLC）,從而使肌球蛋白頭部Mg2+- ATP酶被激活,此酶水解ATP產(chǎn)生的能量使肌動蛋白和肌球蛋白相互作用,從而引發(fā)膀胱平滑肌收縮。這一機制在糖尿病小鼠模型中是否發(fā)生障礙，目前國內(nèi)外還未見相關(guān)研究報道。我們使用C57BL/6小鼠建立1型糖尿病模型，應(yīng)用免疫組化及Western blot的實驗

4、方法研究M3受體、MLCK及p-MLC在小鼠膀胱組織中的表達，從而探究DBD的發(fā)病機制。
　　方法：
　　1、實驗動物分組：36只C57BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后被隨機分為6組，即正常對照組A1、B1、C1，1型糖尿病組A2、B2、C2，每組各6只。A1及A2組、B1及B2組、C1及C2組分別于糖尿病病程8周、20周及24周時處死小鼠進行實驗。
　　2、1型糖尿病小鼠模型制備：將小鼠禁食8小時后稱取其體重，按0.2m

5、g/g的劑量腹腔注射已配制好的STZ溶液，72小時后尾靜脈取血使用血糖儀及血糖試紙監(jiān)測小鼠的血糖變化，空腹血糖連續(xù)3次檢測大于18mmol/l即認定為1型糖尿病模型制備成功。
　　3、于糖尿病病程8周、20周及24周時處死小鼠取出膀胱組織，進行膀胱組織的固定、包埋和切片。
　　4、蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosinstaining，HE）觀察小鼠膀胱組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。
　　5、免疫組化檢測小鼠膀胱組

6、織上M3受體、MLCK、p-MLC的表達及定量分析。
　　6、Western blot檢測小鼠膀胱組織上M3受體、MLCK、p-MLC的表達及定量分析。
　　結(jié)果：
　　1、給予C57BL/6小鼠腹腔注射STZ后，72小時后尾靜脈取血測空腹血糖，血糖均大于18mmol/L，所以認定1型糖尿病小鼠模型造模成功。在第8周（P＜0.05）、20周（P＜0.05）及24周（P＜0.05）時分別檢測小鼠體重后發(fā)現(xiàn)，和正常對照組小

7、鼠相比，1型糖尿病組小鼠體重均明顯下降。經(jīng)STZ腹腔注射處理的C57BL/6小鼠血糖與正常對照組小鼠相比，于第8周（P＜0.05）、20周（P＜0.05）及24周（P＜0.05）時顯著升高。
　　2、病理形態(tài)學(xué)觀察
　　與正常對照組相比，1型糖尿病組小鼠膀胱尿路上皮完整，細胞排列整齊，無上皮糜爛及潰瘍形成，膀胱平滑肌細胞無明顯變性、肥大及萎縮。
　　3、免疫組化實驗
　　3.1、M3受體主要在小鼠膀胱平滑肌細胞胞

8、漿、膀胱尿路上皮細胞胞漿內(nèi)表達，部分膀胱平滑肌細胞膜上可見表達。免疫組化定量分析顯示，糖尿病病程8周、20周及24周時，M3受體在1型糖尿病小鼠膀胱平滑肌中表達均高于正常對照組（P＜0.05），M3受體在1型糖尿病小鼠膀胱尿路上皮中表達在糖尿病病程8周時高于正常對照組（P＜0.05），在糖尿病病程20周和24周時與正常對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.2、MLCK主要在小鼠膀胱平滑肌細胞及膀胱尿路上皮細胞胞漿內(nèi)表達，在膀胱尿路上

9、皮細胞下層中毛細血管內(nèi)皮也可見表達；免疫組化定量分析顯示，糖尿病病程8周、20周及24周時，MLCK在1型糖尿病小鼠膀胱平滑肌中表達均高于正常對照組（P＜0.05），在1型糖尿病小鼠膀胱尿路上皮中表達與正常對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.3、p-MLC主要在小鼠膀胱平滑肌細胞及膀胱尿路上皮細胞胞漿內(nèi)表達，在膀胱尿路上皮細胞下層中毛細血管內(nèi)皮也可見表達；免疫組化定量分析顯示，糖尿病病程8周、20周及24周時，p-MLC在1型糖尿

10、病小鼠膀胱平滑肌中表達均高于正常對照組（P＜0.05），在1型糖尿病小鼠膀胱尿路上皮中表達與正常對照組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4、Western blot實驗
　　4.1、M3受體在1型糖尿病小鼠膀胱組織中的表達于糖尿病病程8周、20周及24周時均高于正常對照組（P＜0.05）。
　　4.2、MLCK在1型糖尿病小鼠膀胱組織中的表達于糖尿病病程8周、20周及24周時均高于正常對照組（P＜0.05）。
　　4.3

11、、p-MLC在1型糖尿病小鼠膀胱組織中的表達于糖尿病病程8周、20周及24周時均高于正常對照組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、糖尿病病程8周、20周及24周時，M3受體、MLCK及p-MLC在1型糖尿病小鼠膀胱組織中表達均高于正常對照組，且主要在膀胱平滑肌細胞中表達增高，表明在糖尿病發(fā)病過程中，M3受體介導(dǎo)的膀胱平滑肌細胞收縮機制被激活。
　　2、糖尿病病程8周時，M3受體、MLCK及p-MLC在1型糖尿病小鼠