tBHQ對無機(jī)砷致人皮膚角質(zhì)細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、砷是一種常見的環(huán)境毒物，長期暴露于無機(jī)砷存在的環(huán)境中可以引起人體多系統(tǒng)和器官的疾病，砷暴露對地方性砷中毒病區(qū)的居民健康生活和經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成嚴(yán)重的影響。大量砷對皮膚角質(zhì)細(xì)胞影響的體內(nèi)體外研究均已證實，無機(jī)砷暴露能夠誘導(dǎo)人皮膚角質(zhì)細(xì)胞凋亡，影響細(xì)胞的正常增殖和引起細(xì)胞損傷。
　　 細(xì)胞凋亡是一種有序或程序性的細(xì)胞死亡方式，受基因調(diào)控的細(xì)胞主動性死亡過程，是細(xì)胞核受某些特定信號刺激后進(jìn)行的生理應(yīng)答反應(yīng)，所以細(xì)胞凋亡又被稱為細(xì)胞程序性死亡

2、。機(jī)體正常的細(xì)胞凋亡過程調(diào)節(jié)失控，機(jī)體會失去穩(wěn)定性而引發(fā)人類腫瘤、免疫系統(tǒng)損傷等多種疾病。一般認(rèn)為，細(xì)胞凋亡的發(fā)生主要存在兩條信號通路的調(diào)控機(jī)制，分別為線粒體通路（內(nèi)部）和死亡受體通路（外部）。研究表明，在線粒體通路中，ROS的堆積可以導(dǎo)致線粒體膜脂質(zhì)過氧化和功能受損，造成質(zhì)子電化學(xué)梯度耗散，△Ψm降低，引起線粒體膜的破裂和蛋白質(zhì)活性物質(zhì)如CytC釋放，繼之Caspase瀑布式活化，最終引起細(xì)胞凋亡。
　　 叔丁基對苯二酚(tB

3、HQ)是一種常見的抗氧化劑，有研究發(fā)現(xiàn)，在PC12細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞中，tBHQ可以通過線粒體途徑發(fā)揮抗凋亡作用，而且能夠影響凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2家族蛋白的表達(dá)。另外，tBHQ是Nrf2轉(zhuǎn)移入核的強(qiáng)烈誘導(dǎo)劑，具有極強(qiáng)的抗氧化作用，因此，tBHQ可以通過提高細(xì)胞的抗氧化水平從而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。但是目前，tBHQ對砷誘導(dǎo)的角質(zhì)細(xì)胞凋亡的可能影響尚未見報道。
　　 綜上所述，本研究擬選用人永生化表皮細(xì)胞HaCaT細(xì)胞系，探討tB

4、HQ在無機(jī)砷誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞凋亡過程中的作用，觀察tBHQ對內(nèi)源性線粒體凋亡通路和凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2等蛋白表達(dá)的影響，試圖揭示可能的機(jī)制。本研究將為預(yù)防和治療無機(jī)砷誘導(dǎo)的皮膚氧化損傷效果等提供新的實驗依據(jù)和線索。
　　 研究方法
　　 1.Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞儀法測定細(xì)胞凋亡率
　　 2.熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)改變
　　 3.JC-1染色流式細(xì)胞儀法測定線粒體膜電位改變
　　

5、 4.分光光度法檢測Caspase-3蛋白活力
　　 5.Western blot法分析細(xì)胞內(nèi)Caspase-3、CytC、Nrf2、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平
　　 結(jié)果
　　 1.tBHQ對NaAsO2致HaCaT細(xì)胞凋亡的拮抗作用
　　 形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，tBHQ50μmol/L預(yù)處理12 h后再暴露于NaAsO2(5，30μmol/L)細(xì)胞中凋亡細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞核碎片和凋亡小體均減少。Annexin

6、 V/PI雙染流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)，NaAsO2(10和30μmol/L)單獨作用HaCaT細(xì)胞，細(xì)胞凋亡率隨染砷濃度增加而升高，差異具有顯著性(p＜0.01)。而tBHQ(10、25、50μmol/L)預(yù)處理后，細(xì)胞凋亡率與相同濃度NaAsO2單獨作用組相比明顯降低，且差異具有統(tǒng)計性(p＜0.01或p＜0.05)。
　　 此外，NaAsO2單獨作用HaCaT細(xì)胞，JC-1染色法流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞線粒體膜電位破壞率隨染砷

7、濃度增加而升高，差異具有顯著性(p＜0.01)。給予tBHQ預(yù)處理后，線粒體膜電位破壞率與相同濃度NaAsO2單獨作用組相比明顯恢復(fù)，且差異具有統(tǒng)計性(p＜0.01或p＜0.05)。
　　 對凋亡相關(guān)蛋白檢測發(fā)現(xiàn)，NaAsO2單獨作用于HaCaT細(xì)胞24 h，線粒體中CytC蛋白表達(dá)降低，而胞漿中Cyt C蛋白表達(dá)則隨染砷劑量的增加而明顯升高。tBHQ預(yù)處理12h后再分別暴露于NaAsO2，線粒體中CytC蛋白表達(dá)明顯恢復(fù)，胞漿

8、中Cyt C蛋白表達(dá)則隨tBHQ劑量的增加而明顯回落。此外，NaAsO2單獨作用于HaCaT細(xì)胞24 h，procaspase-3蛋白表達(dá)降低，而Caspase-3活化程度均顯著高于對照組(p＜0.01)，tBHQ預(yù)處理12h后再暴露于NaAsO2，procaspase-3蛋白表達(dá)均明顯高于相同濃度砷單獨作用組，而且Caspase-3酶活力得到明顯抑制，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05或p＜0.01)。
　　 2.tBHQ對N

9、aAsO2致HaCaT細(xì)胞內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)的影響
　　 tBHQ單獨作用可誘導(dǎo)HaCaT全細(xì)胞Nrf2和細(xì)胞核內(nèi)Nrf2蛋白表達(dá)，且均明顯高于對照組。tBHQ預(yù)處理再與NaAsO2共同處理，Nrf2蛋白表達(dá)均明顯高于相同濃度NaAsO2單獨作用組。
　　 3.tBHQ對NaAsO2致HaCaT細(xì)胞內(nèi)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響
　　 NaAsO2單獨作用于HaCaT細(xì)胞24h，與對照組相比Bcl-2蛋白表達(dá)

10、降低，而Bax蛋白表達(dá)明顯升高。tBHQ預(yù)處理12 h后再分別暴露于NaAsO2，Bcl-2蛋白表達(dá)明顯恢復(fù)，而Bax蛋白表達(dá)則隨tBHQ劑量的增加而明顯回落。
　　 結(jié)論：
　　 1.tBHQ對無機(jī)砷致人皮膚角質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞凋亡具有一定的拮抗作用。
　　 2.tBHQ能夠影響線粒體凋亡途徑拮抗NaAsO2誘導(dǎo)的人皮膚角質(zhì)細(xì)胞凋亡。
　　 3.tBHQ能夠誘導(dǎo)核因子Nrf2和調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax