化膿隱秘桿菌溶血素蛋白誘導小鼠巨噬細胞凋亡的研究.pdf

1、化膿隱秘桿菌(Arcanobacterium pyogenes)是革蘭氏陽性短棒狀桿菌，是牛、羊和豬等重要經(jīng)濟動物的條件性致病菌，常寄生于上呼吸道和消化道的黏膜處，可引起多種器官和黏膜的化膿性感染，給養(yǎng)殖業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。Pyolysin(PLO)是化膿隱秘桿菌分泌的一種外毒素，是化膿隱秘桿菌的一種重要毒力因子，具有溶細胞等生物學活性。但是溶血素在化膿隱秘桿菌感染宿主的過程中的毒力機制，目前尚不十分清楚。
　　 本研究克隆了

2、編碼化膿隱秘桿菌溶血素蛋白的plo基因，進行原核表達PLO，檢測表達蛋白的溶血活性，發(fā)現(xiàn)表達的重組PLO蛋白具有明顯的溶血活性，并利用重組蛋白制備了多克隆抗體，所制備的多抗能夠有效的阻斷溶血素的溶血活性。
　　 將重組PLO蛋白作用小鼠腹膜巨噬細胞RAW264.7，光學顯微鏡與電子顯微鏡觀察表明重組PLO能夠誘導RAW264.7細胞發(fā)生明顯的細胞凋亡現(xiàn)象，如凋亡小體的出現(xiàn)、核固縮、染色質(zhì)聚集等;DNA Ladder檢測結(jié)果顯示，

3、染色體DNA在瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)典型的“梯形”條帶;Annexin V法檢測細胞凋亡率，流式細胞儀分析結(jié)果顯示:0.5μg/mL溶血素處理RAW264.7細胞48小時后細胞凋亡率達到50.1％; MTT法檢測PLO對RAW264.7細胞的增殖抑制作用，結(jié)果顯示:一定濃度下溶血素蛋白對小鼠RAW264.7有明顯的增殖抑制作用，呈劑量和時間依賴性;試劑盒檢測caspase3的活性，發(fā)現(xiàn)caspase3活性均比對照組升高;并檢測重組PLO蛋

4、白對RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10等細胞因子的影響，結(jié)果顯示:RAW264.7細胞負載溶血素后TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10細胞因子分泌量有不同程度的提高。這表明溶血素蛋白能夠誘導巨噬細胞發(fā)生凋亡，并產(chǎn)生一系列細胞因子。
　　 綜上所述，本研究原核表達了化膿隱秘桿菌溶血素蛋白，鑒定其生物學功能并將其作用于小鼠巨噬細胞RAW264.7，研究溶血素誘導小鼠巨噬細胞凋亡，為溶