Indian Hedgehog信號(hào)通路相關(guān)因子在氟中毒大鼠軟骨組織及軟骨細(xì)胞中的表達(dá)及其意義.pdf

1、目的:通過(guò)檢測(cè)慢性氟中毒大鼠軟骨組織及其軟骨細(xì)胞中Ihh、Smo、PTHrp蛋白與mRNA表達(dá)水平變化，探討Indian hedgehog（Ihh）信號(hào)通路在慢性氟中毒體內(nèi)及體外的作用與機(jī)制。
　　方法:1、建立動(dòng)物染氟模型，SD大鼠36只，按體重隨機(jī)分為3組，每組12只，對(duì)照組：氟離子濃度<1 mg/L、低氟中毒組：NaF濃度5 mg/L、高氟中毒組：NaF濃度50 mg/L。飼養(yǎng)6個(gè)月后應(yīng)用氟離子選擇電極法測(cè)定尿氟，股骨骨氟，

2、蘇木素-伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色后光鏡下觀察軟骨組織形態(tài)學(xué)病理改變；免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）PV-6001法檢測(cè)大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織中Ihh、Smo、PTHrp蛋白以及凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2、Bax和增殖調(diào)控蛋白Cyclin D1、PCNA表達(dá)情況。2、建立細(xì)胞染氟模型，原代培養(yǎng)乳鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，傳第3代后按染氟濃度不同分為0（對(duì)照）、5、10、20、40 mg/L

3、組，噻唑藍(lán)（MTT）、流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各組細(xì)胞增殖、凋亡的變化。蛋白印跡（Western Blot）和逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測(cè)各組染氟48 h后Ihh信號(hào)通路中Ihh、Smo、PTHrp的蛋白及其mRNA表達(dá)含量。
　　結(jié)果:1、慢性氟中毒大鼠模型建立成功。與對(duì)照組（1.73±0.07、1.95±0.06）相比，低、高氟組大鼠尿氟、骨氟含量（2.34±0.21、4.33±0.46；98.81±9.03、131.52±9.

4、14）逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；2、光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，隨著染氟劑量增加，低、高氟組較對(duì)照組關(guān)節(jié)軟骨組織明顯變薄且排列紊亂，部分細(xì)胞有變性。3、大鼠軟骨組織免疫組化與Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，低、高氟組Ihh、Smo、PTHrp、Bax蛋白表達(dá)逐漸升高，而低、高氟組Bcl-2、Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。4、成功獲得了性狀和表型一致的大鼠軟骨細(xì)胞，MTT結(jié)

5、果顯示，與對(duì)照組比較，各時(shí)間段5 mg/L染氟組細(xì)胞增殖率[1.10±0.08、1.13±0.08、1.15±0.08比1.17±0.07、1.20±0.06、1.16±0.08]明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），40 mg/L染氟組細(xì)胞48h、72h增殖活性[0.72±0.11、0.68±0.04]則顯著降低（P<0.05）。流式檢測(cè)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比較，24、48、72 h時(shí)40 mg/L染氟組軟骨細(xì)胞凋亡率逐漸增高[

6、（19.87±3.03）％、（25.30±1.28）%、（45.73±4.63）%]差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。5、與對(duì)照組相比，培養(yǎng)48 h后 Ihh、Smo、PTHrp的蛋白及其mRNA表達(dá)在染氟各組（Ihh蛋白：0.77±0.08比0.98±0.07、1.23±0.06、1.37±0.07、1.34±0.07；PTHrp蛋白：0.68±0.04比0.89±0.05、0.83±0.05、1.29±0.05、1.16±0.08；

7、Smo蛋白：0.37±0.01比0.64±0.06、0.67±0.03、0.96±0.06、0.69±0.06，Ihh mRNA：0.77±0.05比0.98±0.05、1.09±0.05、1.27±0.03、1.46±0.06；PTHrp mRNA：0.67±0.07比0.97±0.05、1.07±0.08、1.37±0.05、1.45±0.05；Smo mRNA：0.45±0.03比0.63±0.04、0.71±0.05、0.81±