DDX17調(diào)控HBV復(fù)制的分子機(jī)制.pdf

1、目的：HBV感染過程是病毒與宿主因子發(fā)生相互作用、相互影響的過程。在抵御病毒感染方面，一些細(xì)胞內(nèi)宿主因子具有抗病毒效應(yīng)，從而對宿主免疫系統(tǒng)有補(bǔ)充作用。DExD/H-box家族蛋白是RNA解旋酶家族中重要亞家族。有研究報道該家族中一些成員可參與抵抗病毒感染。然而關(guān)于DExD/H-box家族蛋白在HBV復(fù)制調(diào)控中作用的報道非常有限。本研究篩選了可抑制HBV復(fù)制的DExD/H-box家族成員，并對其中的DDX17在HBV復(fù)制調(diào)控中的作用及分子

2、機(jī)制進(jìn)行了研究。
　　方法：
　　1.通過NCBI/BLAST數(shù)據(jù)庫查詢目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的所有DExD/H-box解旋酶家族蛋白種類；
　　2.以HepG2細(xì)胞來源cDNA為模板，利用RT-PCR方法，分別擴(kuò)增DExD/H-box家族基因家族基因，并將目的基因片段連接至載體pCH9；
　　3.構(gòu)建HBV核心啟動子熒光素酶報告基因pCH9-pcore-Rluc；
　　4.在HepG2細(xì)胞中，分別共轉(zhuǎn)染各種目的基因

3、表達(dá)質(zhì)粒與pCH9-pcore-Rluc或空載體與pCH9-pcore-Rluc，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞進(jìn)行熒光素酶報告檢測；
　　5.使用Western blot檢測方法鑒定DDX17在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)水平；
　　6.使用Southern blot檢測方法鑒定過表達(dá)DDX17對HepG2細(xì)胞中HBV復(fù)制中間體表達(dá)水平的影響；
　　7.使用Western blot檢測方法鑒定DDX17在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)水平；<

4、br>　　8.使用Southern blot檢測方法鑒定過表達(dá)DDX17對Huh7細(xì)胞中HBV復(fù)制中間體表達(dá)水平的影響；
　　9.使用Northern blot檢測方法鑒定過表達(dá)DDX17對HepG2細(xì)胞中HBV轉(zhuǎn)錄水平的影響；
　　10.使用Northern blot檢測方法鑒定過表達(dá)DDX17對Huh7細(xì)胞中HBV轉(zhuǎn)錄水平的影響；
　　11.通過ELISA方法檢測過表達(dá)DDX17對肝癌細(xì)胞HepG2上清中HBeAg

5、分泌量的影響；
　　12.通過ELISA方法檢測過表達(dá)DDX17對肝癌細(xì)胞Huh7上清中HBeAg分泌量的影響；
　　13.通過ELISA方法檢測過表達(dá)DDX17對肝癌細(xì)胞HepG2上清中HBsAg分泌量的影響；
　　14.通過ELISA方法檢測過表達(dá)DDX17對肝癌細(xì)胞Huh7上清中HBsAg分泌量的影響；
　　15.通過RT-PCR方法檢測DDX17對ER-α、ZAP或IFN信號途徑中節(jié)點(diǎn)分子表達(dá)水平的影響；

6、
　　16.構(gòu)建DDX17基序Ic和基序II突變體A1004T+C1007G、A1077C+A1086C；
　　17.將質(zhì)粒DDX17TPGRM、DDX17DEADM、wtDDX17或DDX17空載與HBV1.3共轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，裂解細(xì)胞并進(jìn)行Southern blot檢測和Northern blot檢測；
　　18.體外轉(zhuǎn)錄HBVε莖環(huán)結(jié)構(gòu)，并與過表達(dá)DDX17的細(xì)胞蛋白裂解液進(jìn)行共孵育，進(jìn)行RNA-Protei

7、n Pull-Down實(shí)驗(yàn)；
　　19.利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建DDX17基因敲除HepG2細(xì)胞系，使用測序及Western blot方法鑒定DDX17表達(dá)是否缺失；
　　20.在DDX17KO細(xì)胞中過表達(dá)外源DDX17表達(dá)質(zhì)粒，利用Western blot檢測DDX17蛋白表達(dá)水平；
　　21.在DDX17KO細(xì)胞中共表達(dá)DDX17空載體質(zhì)粒與HBV1.3，做Real-time PCR檢測分析和Southe

8、rn blot檢測；
　　22.在DDX17KO和HepG2細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)染pCH9-pcore-Rluc和CMV-Fluc，做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析；
　　23.在HepG2-DDX17KO細(xì)胞中，分別共轉(zhuǎn)染DDX17、pCH9-pcore-Rluc與CMV-Fluc或者vector、pCH9-pcore-Rluc與CMV-Fluc做雙熒光素酶報告檢測分析；
　　24.構(gòu)建HBV核心啟動子截短突變體；
　　25

9、.在HepG2細(xì)胞中分別共轉(zhuǎn)上述突變體與CMV-Fluc，做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析；
　　26.在DDX17KO和HepG2細(xì)胞中分別共表達(dá)pCH9-BCP-Rluc和CMV-Fluc做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析；
　　27.在DDX17KO和HepG2細(xì)胞中分別共表達(dá)pCH9-1636-Rluc和CMV-Fluc、pCH9-1635/1744-Rluc和Fluc做雙熒光素酶報告系統(tǒng)分析。
　　結(jié)果：
　　1.目前已

10、經(jīng)發(fā)現(xiàn)的人源性DExD/H-box RNA解旋酶有58個，包括16個DHX（DEAH/DExH家族）和42個DDX（DEAD/DExD家族）；
　　2.成功構(gòu)建27種DExD/H-box RNA解旋酶基因真核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒；
　　3.成功構(gòu)建HBV核心啟動子熒光素酶報告質(zhì)粒pCH9-pcore-Rluc；
　　4.與對照組相比，DDX17可以顯著負(fù)向調(diào)控HBV啟動子活性（P＜0.0001）；
　　5.與對照組相比，

11、在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染DDX17表達(dá)質(zhì)粒后DDX17蛋白表達(dá)水平明顯升高；
　　6.與對照組相比，在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)DDX17后HBV復(fù)制中間體表達(dá)水平明顯下降；
　　7.與對照組相比，在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染DDX17表達(dá)質(zhì)粒后DDX17蛋白表達(dá)水平明顯升高；
　　8.與對照組相比，在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)DDX17后HBV復(fù)制中間體表達(dá)水平明顯下降；
　　9.與對照組相比，在HepG2細(xì)胞中過表達(dá)DDX17后

12、HBV3.5/3.4kb RNA和2.4/2.1kb RNA表達(dá)水平均明顯下降；
　　10.與對照組相比，在Huh7細(xì)胞中過表達(dá)DDX17后HBV3.5/3.4kb RNA和2.4/2.1kb RNA表達(dá)水平均明顯下降；
　　11.在HepG2細(xì)胞中，與對照組相比，過表達(dá)DDX17后HBeAg分泌量顯著低于對照組（P=0.0032）；
　　12.在Huh7細(xì)胞中，與對照組相比，過表達(dá)DDX17后HBeAg分泌量顯著低于

13、對照組（P＜0.0001）；
　　13.在HepG2細(xì)胞中，與對照組相比，過表達(dá)DDX17后HBsAg分泌量顯著低于對照組（P=0.0004）；
　　14.在Huh7細(xì)胞中，與對照組相比，過表達(dá)DDX17后HBsAg分泌量顯著低于對照組（P=0.0035）；
　　15.未發(fā)現(xiàn)過表達(dá)DDX17后與對照組中ER-α、ZAP或IFN信號途徑中節(jié)點(diǎn)分子mRNA表達(dá)水平有顯著差異；
　　16.成功構(gòu)建DDX17基序Ic和基

14、序II突變體TPGRM和DEADM；
　　17.突變TPGR結(jié)構(gòu)域后，HBV DNA及HBV RNA水平明顯高于DDX17野生型對照組、而接近空載體對照組；而突變DEAD結(jié)構(gòu)域則未發(fā)現(xiàn)HBV DNA及HBV RNA與DDX17野生型對照組有明顯差異；
　　18.HBV?莖環(huán)并不能直接與DDX17發(fā)生結(jié)合；
　　19.成功構(gòu)建4個HepG2-DDX17KO細(xì)胞系；
　　20.DDX17KO細(xì)胞本身并不表達(dá)DDX17

15、蛋白，外源DDX17表達(dá)質(zhì)粒c-Myc-DDX17可以在DDX17KO細(xì)胞中正常表達(dá)；
　　21.Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)DDX17KO細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒與HBV1.3后檢測到的HBV復(fù)制中間體表達(dá)水皮顯著高于對照細(xì)胞系HepG2（P=0.0101），Southern blot結(jié)果同樣發(fā)現(xiàn)DDX17KO細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染空載體質(zhì)粒與HBV1.3檢測到的HBV復(fù)制中間體表達(dá)水平明顯高于對照細(xì)胞系HepG2；
　　22.

16、與對照細(xì)胞系HepG2相比，DDX17KO細(xì)胞中Rluc活性顯著升高（P＜0.0001）；
　　23.與對照組相比，DDX17KO細(xì)胞中補(bǔ)充外源DDX17后Rluc活性顯著下降（P=0.0004）；
　　24.成功構(gòu)建HBV核心啟動子截短突變體；
　　25. DDX17可抑制pCH9-pcore-Rluc啟動子活性，而對截短體，無論是同時缺失Enh I和Enh II，或者缺失Enh I，均表現(xiàn)為正向調(diào)控作用；Enh I

17、的貢獻(xiàn)率超過85%，而Enh II僅達(dá)8.5%；并且與對照組相比，過表達(dá)DDX17后Enh I貢獻(xiàn)率下降11%，過表達(dá)DDX17后Enh II及BCP貢獻(xiàn)率均有小幅度升高；
　　26.與對照細(xì)胞系相比，DDX17KO細(xì)胞BCP啟動子活性并無顯著差異；
　　27.與對照細(xì)胞系相比，DDX17KO細(xì)胞中pCH9-1636-Rluc啟動子活性顯著降低（P=0.0256），pCH9-1635/1744-Rluc啟動子活性顯著升高（P